麻仁润肠丸、大黄和大黄素对大鼠大肠神经系统影响的研究

娄秀辉 黄光明 王楠 万欣 葛欣 李景瑞

便秘是一种影响人类健康和生活质量的常见疾病。据北京、西安、天津等地的调查发现便秘的发生率可达6.07%～9.18%[1]。便秘的发病原因目前尚不十分清楚，但其中大多数患者为功能性疾患。对功能性便秘的治疗应遵循个体化治疗的原则，对于中、重度的便秘，短期或长期的药物治疗是主要的治疗手段。我国传统的中药对功能性便秘的治疗有着得天独厚的优势，麻仁润肠丸即是我国传统复方中药的一个代表。但是，关于麻仁润肠丸的研究还停留在临床经验方面，对麻仁润肠丸的作用机理还没有系统的研究，还有很多问题需要解决。有鉴于此，我们对比研究麻仁润肠丸、大黄和大黄素泻下作用的效果和副作用，并对麻仁润肠丸的作用机制作一初步的探讨，希望我们的研究可以为麻仁润肠丸的临床应用寻找理论上的依据。

材料与方法

一、材料

1.主要试剂：麻仁润肠丸购自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，大黄粉由本院自制，大黄素和MTT均购自美国Sigma公司，CHAT一抗购自美国Santa Cruz公司，nNOS和β-Tubulin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，荧光标记的二抗购自Invitrogen公司，其他使用的试剂均为分析纯。

2.药物配制与给药：麻仁润肠丸组：将麻仁润肠丸溶于5%羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium，CMC)配制成640 mg/ml的混悬液，按照3200 mg/kg/d灌胃给药；大黄组：大黄粉溶于5% CMC配制成160 mg/ml的混悬液，按照800 mg/kg/d灌胃给药；大黄素组：将大黄素用5% CMC配制成8 mg/ml的混悬液，按照40 mg/kg/d灌胃给药。正常对照组给予相当体积的5% CMC。麻仁润肠丸、大黄以及大黄素的用量参考人体用量和其它参考文献。

3.动物饲养与分组：清洁级SD大鼠192只，购于哈尔滨医科大学附属第三医院动物中心，雌雄不拘，8到10周龄，体重170～200 g。分组采用随机数字表的方法。96只大鼠随机分为正常对照组、麻仁润肠丸组、大黄组和大黄素组，用于检测大鼠一般状况、肠道传输功能，其中每组12只动物用于7 d时大肠运动频率和幅度检测、每组另12只动物用于一般状况和28 d时大肠运动频率和幅度检测。另96只大鼠随机分为正常对照组、麻仁润肠丸组、大黄组和大黄素组，其中每组12只动物于7 d时检测肠壁组织、肠道传输功能、肠壁肠肌丛内神经的变化情况，每组另12只动物于28 d检测上述指标。

二、方法

1.检测大鼠一般状况：目测各组大鼠皮毛色泽、活动度及精神状态等的变化；检测各组大鼠在实验开始前1 d和实验开始后1 d、4 d、7 d、14 d、28 d大便颗粒数和大便总重量；测量各组大鼠体重在上述时间点的变化。

2.检测大鼠大肠肠壁组织在光学显微镜下的情况：检测正常对照、麻仁润肠丸、大黄和大黄素组大鼠在实验7 d、28 d光镜下黏膜层的厚度、绒毛高度、隐窝深度的改变；

肠道组织学观察及评分：参照文献[2]，各组动物在实验7 d、28 d处死，分离结肠，自距肛门10 cm处沿长轴剖开结肠，冰生理盐水反复冲洗肠腔，肉眼观察大肠黏膜损伤程度，取肠组织一部分以40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，HE染色后光学显微镜下观察组织病理改变，并对大肠组织学损伤进行评分[3]：无明显炎症，肠壁黏膜组织和隐窝深度正常为0分；少量淋巴细胞浸润(≤10%高倍视野)，肠壁并无结构的改变为1分；中量淋巴细胞浸润(10%～25%高倍视野)，隐窝稍变深，肠壁增厚，但未透过黏膜层，无溃疡形成为2分；明显淋巴细胞浸润(25%～50%高倍视野)，血管密度增加，隐窝变深，肠壁增厚，透过黏膜层：3分；大量淋巴细胞浸润(≥50%高倍视野)，血管密度增加，隐窝变深并扭曲，肠壁全层增厚，可见溃疡形成为4分。

3.检测大鼠肠道运动功能的情况：(1)分别在实验7 d、28 d做墨汁推进实验[4]，比较正常对照、麻仁润肠丸、大黄和大黄素组大鼠肠道内墨汁推进距离的差异。(2)分别在实验7 d、28 d检测大鼠的结肠肌电活动[5]，比较正常对照、麻仁润肠丸、大黄和大黄素组大鼠结肠肌电活动的区别。

4.检测大鼠肠壁肠肌丛内神经元的情况：Western Blot 法检测正常对照、麻仁润肠丸、大黄和大黄素组大鼠在实验7 d、28 d时肠肌丛内的CHAT和nNOS蛋白表达，比较各组的差异。

三、统计方法

数据均以Means±SE表示，每个实验至少重复三次。组间单变量统计分析采用one-way ANOVA法；组间两个单独变量统计分析采用Tukeyposthoc检测以及two-way ANOVA法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠一般状况的检测结果

麻仁润肠丸、大黄和大黄素组大鼠和对照组相比，在体重、大便总重和大便例数方面都有变化，麻仁组变化最轻(表1)。

二、大鼠大肠肠壁组织在光学显微镜下检测结果

实验7 d、28 d在光学显微镜下观察大鼠大肠组织，其病理评分见表2。

三、大鼠肠道传输率的检测结果

麻仁润肠丸组大鼠于7 d、28 d肠道传输速率分别为77.1±4.6和75.4±4.2，均明显快于正常对照组65.2±4.3和65.8±4.4(P<0.05)。大黄组大鼠于7 d肠道传输速率分别为78.3±4.8，也明显快于正常对照组(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较无明显变化；于28 d肠道传输速率分别为68.7±3.5，明显快于正常对照组(P<0.05)，明显慢于麻仁润肠丸组(P<0.05)。大黄素组大鼠于7 d肠道传输速率分别为78.7±5.0，明显快于正常对照组(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较无明显变化；于28 d肠道传输速率分别为67.2±3.1，明显快于正常对照组(P<0.05)，明显慢于麻仁润肠丸组(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠肠道传输速率(Means±SE)

表4 各组大鼠结肠慢波频率与振幅(Means±SE)

四、大鼠的结肠慢波频率与振幅的检测结果

麻仁润肠丸组大鼠于7 d、28 d的结肠慢波频率与振幅分别为17.23±1.76与0.57±0.08、16.87±1.76与0.56±0.08，均明显快于和高于正常对照组的11.76±1.89与0.45±0.10、11.38±1.87与0.44±0.11(P<0.05)。大黄组大鼠于7 d的结肠慢波频率与振幅分别为18.01±1.65与0.58±0.08，明显快于和高于正常对照组(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较无明显变化；于28 d的结肠慢波频率与振幅分别为13.54±1.85与0.52±0.08，明显快于和高于正常对照组(P<0.05)，明显慢于和低于麻仁润肠丸组(P<0.05)。大黄素组大鼠于7 d的结肠慢波频率与振幅分别为18.54±1.83与0.59±0.07，明显快于和高于正常对照组(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较亦无明显变化；于28 d的结肠慢波频率与振幅分别为13.24±1.21与0.51±0.07，明显快于和高于正常对照组(P<0.05)，明显慢于和低于麻仁润肠丸组(P<0.05，表4)。

五、大鼠肠壁肠肌丛内CHAT和nNOS蛋白表达量的变化

在于实验7 d、28 d通过Western Blot法检测四组大鼠肠肌丛内的CHAT和nNOS蛋白表达。

1.CHAT蛋白检测结果显示：麻仁润肠丸组于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分别是正常对照组的1.11、0.95倍，与正常对照组比较无明显变化；大黄组于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分别是正常对照组的1.73、0.72倍，与正常对照组比较均有明显变化(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较亦均有明显变化(P<0.05)；大黄素组于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分别是正常对照组的2.24、0.61倍，与正常对照组比较均有明显变化(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较亦均有明显变化(P<0.05，图1)。

注：C为正常对照组；M为麻仁润肠丸组；R为大黄组；E为大黄素组，*代表与对照组比较P<0.05，#代表与麻仁润肠丸组比较P<0.05

2.nNOS蛋白检测结果显示：麻仁润肠丸组于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分别是正常对照组的0.94、1.13倍，与正常对照组比较无明显变化；大黄组于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分别是正常对照组的0.83、1.75倍，与正常对照组比较均有明显变化(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较亦均有明显变化(P<0.05)；大黄素组于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分别是正常对照组的0.64、2.32倍，与正常对照组比较均有明显变化(P<0.05)，与麻仁润肠丸组比较亦均有明显变化(P<0.05，图2)。

注：(n=3，means±SE，*代表与对照组比较P<0.05，#代表与麻仁润肠丸组比较P<0.05)

讨 论

便秘是一种影响人类健康和生活质量的常见疾病。在发达国家便秘的发生率占人群的10%～15%左右。

泻剂结肠是指长期大剂量服用刺激性泻剂而致结肠神经系统(enteric nervous system,ENS)失调和相应功能紊乱，导致肠动力障碍，对泻剂反应性明显下降，使患者对泻剂产生依赖的一种状况，是慢传输性便秘(slow transit constipation,STC)的一种重要临床类型[6]。

在本实验中，我们首先观察了各给药组大鼠的一般状况和肠壁组织病理状况。结果显示，麻仁润肠丸长期给药后泻下作用可稳定保持、对肠壁组织影响较小，而大黄和大黄素组长期给药后泻下作用减弱、对肠壁组织影响较大，主要表现在大便颗粒数和大便总重量于实验后期增多和增重的幅度明显小于麻仁润肠丸组；动物体重明显减轻；肠壁组织病变情况明显加重。说明长期给药后麻仁润肠丸的泻下作用优于大黄、大黄素；对肠壁组织的损伤小于大黄和大黄素。

1943年，Heibrun[7]研究了27例长期服用泻剂的便秘病人，发现结肠袋状收缩消失、肠腔扩张，黏膜萎缩，黏膜下层有单核细胞浸润和脂肪沉积，并首次提出了“泻剂结肠”的观点。近年的研究借助放射免疫分析、免疫组化等方法发现“泻剂结肠”ENS的多种神经递质含量或分布异常，其特征与STC结肠的变化相似，大鼠“泻剂结肠”肠道传输减慢也符合STC的特点，说明接触性泻剂在STC的发生发展中有促进作用[8]。结肠的肌电活动有3种表现形式:(1)电控制活动(electrical control activity,ECA)，又称慢波或基本电节律。(2)电振荡活动(electrical oscillatory activity,EOA)。(3)电反应活动(electrical response activity,ERA)，又称峰电位或动作电位。动作电位产生于慢波之上，与平滑肌收缩相一致，是推进性运动的主要动力。慢波是相对规律的一种周期性电活动，控制肠道收缩的节律，无论收缩与否始终存在[9]。有研究表明大剂量应用刺激性泻剂可影响结肠慢波的产生和传导。其频率异常会导致肠道的推进性收缩频率减慢或收缩不协调，其振幅降低会导致结肠收缩力下降，结果表现为结肠运动无力，肠道传输功能迟缓。

在本实验中，我们于7 d、28 d检测了大鼠肠道传输速率和结肠慢波频率与振幅。结果显示，麻仁润肠丸长期给药后对大鼠肠道传输速率和结肠慢波频率与振幅影响可稳定保持，而大黄和大黄素组长期给药后对大鼠肠道传输速率和结肠慢波频率与振幅影响变化较大，主要表现在给药后期大鼠的肠道传输速率明显慢于麻仁润肠丸组；大鼠结肠慢波频率与振幅明显慢于和低于麻仁润肠丸组。说明长期给药后麻仁润肠丸对大鼠肠道传输速率和结肠慢波频率与振幅的影响优于大黄和大黄素组。

胃肠运动由交感、副交感神经系统、肠神经系统和Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)组成的肠神经细胞网络控制[10-12]。肠神经系统递质多达数十种，其中兴奋性递质主要包括乙酰胆碱(AchE)、P物质(SP)等；抑制性递质以非肾上腺素非胆碱能神经(NANC)递质为主，包括一氧化氮(NO)、血管活性肠肽(VIP)、生长抑素(SOM)、降钙素基因相关肽(CGRP)、三磷酸腺苷(ATP)等[13]。在结肠肠运动神经元的神经递质中Ach和NO分别是兴奋性和抑制性神经递质的两个典型代表[14-15]。AchE是重要的兴奋性运动神经递质，能使胃肠道平滑肌去极化，促进胃肠蠕动收缩。研究表明，大鼠回肠肌间神经丛内胆碱能神经减少能够引起兴奋性递质减少，肠蠕动减慢，胃肠传输速率延迟[16-17]。另外，Ach使平滑肌细胞膜去极化，刺激肠道壁内胆碱能神经产生兴奋性接头电位(EJPs)，引起平滑肌收缩。NO是以L-精氨酸为底物，在还原性辅酶Ⅱ等因子辅助下由NO合成酶(NOS)催化生成。NOS包括三种亚型：神经型NOS(neuronal NOS,nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)。前两者合称为结构型NOS(constitutive NOS,cNOS)。研究发现nNOS主要分布于大鼠结肠黏膜下神经丛和肌间神经丛神经元，定位于细胞质。当NANC能神经受到刺激时，即释放NO并迅速弥散至平滑肌，使其第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)含量增多，使胞浆Ca2+外流并抑制Ca2+内流，致使胞浆游离Ca2+浓度降低，从而抑制肌动蛋白与肌球蛋白的结合，导致平滑肌舒张，胃肠运动减弱。另外，NO使平滑肌细胞膜超极化，产生抑制性接头电位(IJPs)，而IJPs能破坏或减少环肌和纵肌自发性电节律性活动，降低慢波波幅值。此外，NO也可同其他神经递质或神经肽相互协调，共同影响肠的生理功能。有报道成人功能性便秘患者结肠黏膜下神经丛和肌间神经丛NO阳性神经元数量和密度均较正常组明显增多、增强、黏膜内NO生成量增加[18-19]。

以上实验结果显示，麻仁润肠丸泻下作用温和、长期应用治疗效果优于大黄、大黄素，而其副作用却低于大黄、大黄素，长期应用不会出现严重的毒副反应，适合便秘老年患者长期应用。

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