Stathmin及Cathepsin B在结直肠癌中的表达

杨正多 张丹 吕宏程 张丽 刘光 马卉 王刚 张诗武

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤，其发病率居第四位[1]。肿瘤易发生远处转移而疗效较差，因此探讨与结直肠癌发生发展相关的分子生物学机制对其早期诊断、早期治疗及预后至关重要。细胞周期调控是肿瘤研究的热点之一，细胞周期相关蛋白调节失控与肿瘤的发生发展及转移密切相关。Stathmin蛋白是一种微管不稳定蛋白，主要通过磷酸化和去磷酸化作用来调节细胞微管系统的动力学平衡与稳定，控制细胞周期并调节细胞生物学行为[2]。Stathmin在人体正常组织中几乎不表达，但在多种恶性肿瘤中表达上调，如乳腺癌[3]、结直肠癌[4]、肺癌[5]、喉鳞状细胞癌[6]、内分泌肿瘤[7]和卵巢癌[8]等，其表达水平的高低对肿瘤发生发展及患者生存预后有重要影响。组织蛋白酶(Cathepsin)是位于溶酶体内的一种半胱氨酸蛋白酶超家族，其活性与相应前体蛋白的剪切密切相关。Cathepsin B是该蛋白酶超家族的重要成员之一，其重要的生物学功能之一是作为淀粉样前体蛋白分泌酶参与淀粉样前体蛋白的分解加工，与阿尔兹海默病的发生具有密切关系[9-10]。Cathepsin B还可能介导了一条非caspase的凋亡通路，调控肿瘤细胞发生发展和转移等过程。近年来大量科研报道表明Cathepsin B与肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌[11]，食管癌[12]，子宫内膜癌[13]以及结直肠癌[14]等。本文利用158例结直肠癌患者的临床病理切除标本及64例转移灶的石蜡包埋组织制成组织芯片，利用免疫组织化学方法检测二者的表达及其与肿瘤临床病理分级间的联系，为探讨结直肠癌患者临床病理分级的有用指标提供实验基础。

材料和方法

一、一般资料

收集南开大学人民医院病理科2009年-2013年手术切除、临床病理资料完整的结直肠癌组织存档蜡块158例及64例转移灶组织(发病年龄20岁-86岁，中位年龄61岁)，所有患者术前均未接受放射、化学药物等抗肿瘤治疗。按照WHO分级标准对结直肠癌病例进行组织学分级和TNM分期。

二、试剂和方法

浓缩型兔抗人Cathepsin B多克隆抗体(clone：BA-0428，1：50，Boster Tec.，Wuhan)；即用型兔抗人Stathmin单克隆抗体(clone：RMA-0641，Maixin Bio，Fuzhou),抗鼠或兔即用型免疫组化Maxvision二抗(Kit-5020,Maixin Bio.，Fuzhou)。DAB显色系统购自北京中杉金桥生物公司。免疫组织化学染色采用S-P二步法，均采用柠檬酸钠缓冲液(0.01 M,pH=6.0)高温高压修复，PBS代替一抗作阴性对照。

复查HE染色切片，用定位器对蜡块上具有代表性的组织区域进行定位标记，每例组织选择2-3个位点；使用全自动组织芯片制备仪制作每个位点直径为1.5 mm的组织芯片，4 um厚连续切片，分别行HE染色和免疫组化检测。

三、结果判定

高分化及中分化结直肠癌组织中Stathmin和Cathepsin B以细胞膜和/或细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，低分化结直肠癌组织中Stathmin和Cathepsin B以细胞膜和/或细胞浆以及细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，光镜下观察阳性细胞的数量，采用染色指数计数法。每张切片随机选择5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个以上肿瘤细胞。根据肿瘤细胞阳性个数和染色强度综合评价免疫组化结果。染色强度方面，肿瘤细胞胞浆或胞核无明显染色计1分，染成浅黄色计2分，深棕黄色计3分；阳性细胞数方面：阳性肿瘤细胞数<25%，计0分；阳性肿瘤细胞数≥25%且<50%，计1分；阳性肿瘤细胞数为≥50%且<75%，计2分；阳性肿瘤细胞数≥75%，计3分。染色指数为染色强度和染色阳性细胞数乘积。乘积≥4者为阳性，0～3为阴性[15]。

四、统计学分析

应用SPSS13.0统计软件对数据进行处理，采用四格表确切概率法及Pearsonχ2检验进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

Stathmin蛋白阳性信号主要位于细胞膜和/或细胞质(图1a～c)。Stathmin蛋白在高分化结直肠组织中表达阳性率为53.8%，在中分化肿瘤组织中表达阳性率为56.4%，在低分化肿瘤组织中表达阳性率为64.7%，差异无明显统计学意义(χ2=1.369，P=0.504)。在结直肠癌转移灶中，Stathmin蛋白在高分化组织中表达阳性率为14.3%，在中分化肿瘤组织中表达阳性率为22.2%，在低分化肿瘤组织中表达阳性率为56.4%，差异具有明显统计学意义(分别为χ2=4.212，P=0.040和χ2=5.803，P=0.016，图2)。Stathmin蛋白在低分化结直肠癌细胞核阳性表达(图1d)。

Cathepsin B蛋白阳性信号主要位于细胞膜或细胞质(图1e～g)。Cathepsin B蛋白在高分化结直肠组织中表达阳性率为39.2%，在中分化肿瘤组织中表达阳性率为83.6%，在低分化肿瘤组织中表达阳性率为90.4%，差异具有明显统计学意义(分别为χ2=22.223，P=0.000和χ2=29.651，P=0.001)。在结直肠癌转移灶中，Cathepsin B蛋白在高分化组织中表达阳性率为85.7%，在中分化肿瘤组织中表达阳性率为83.3%，在低分化肿瘤组织中表达阳性率为74.4%，差异无明显统计学意义(χ2=0.845，P=0.655，图3)。Cathepsin B蛋白在低分化结直肠癌细胞核阳性表达(图1h)。

讨 论

目前关于细胞周期及其调控机制在肿瘤发生发展过程中的作用的研究已经取得很大进步，细胞周期的调节失控与肿瘤发生发展密切相关。细胞周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDKs)以及周期蛋白依赖性激酶抑制物(CDK-inhibitors，CDKIs)对细胞周期进行着严格调控。Stathmin蛋白是一种重要的微管解聚蛋白，在细胞周期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化来促进微管的解聚或阻止微管的聚合，Stathmin磷酸化水平与微管的平衡状态及细胞周期的转换密切相关[16]。在细胞外基质中，磷酸化可以降低Stathmin的活性，因此，降低Stathmin磷酸化的点突变可以减弱细胞外基质的稳定性，增加肿瘤细胞侵袭能力[17]，提示Stathmin在肿瘤转移过程中发挥重要作用。Stathmin蛋白的高表达对肿瘤细胞的迁移和肿瘤患者生存预后都有重要影响。因此，Stathmin可能成为肿瘤治疗的新靶点。

Belletti等[18]研究结果显示Stathmin蛋白的过表达可促进软组织肉瘤细胞发生局部组织浸润和远处转移。Singer等[19]报道称在非小细胞肺癌中，Stathmin过表达可以加快肿瘤细胞分裂增殖和基质浸润，增加细胞迁移运动。Zheng等[4]研究结果表明结直肠癌患者中Stathmin均高表达，并且发生肿瘤转移的患者中Stathmin表达水平更高，发生转移和未转移的患者组织中，Stathmin的表达有明显差异，结果具有统计学意义。本研究所得到的相关结果显示Stathmin蛋白在不同分化的结直肠癌组织中均表达上调，并且其高表达与结直肠癌转移呈正相关，与上述文献报道结果相符。

注：a图为Stathmin蛋白在高分化结直肠癌组织中表达的免疫组织化学染色图像，阳性部位定位于肿瘤细胞膜或包浆；b图为Stathmin蛋白在中分化结直肠癌组织中表达的免疫组织化学染色图像，阳性部位定位于肿瘤细胞膜、包浆或包核；c图为Stathmin蛋白在低分化结直肠癌组织中表达的免疫组织化学染色图像；d图为Stathmin蛋白在结直肠癌转移灶组织中表达的免疫组织化学染色图像；e图为Cathepsin B蛋白在高分化结直肠癌组织中表达的免疫组织化学染色图像；f图为 Cathepsin B蛋白在中分化结直肠癌组织中表达的免疫组织化学染色图像；g图为Cathepsin B蛋白在低分化结直肠癌组织中表达的免疫组织化学染色图像；h图为Cathepsin B蛋白在结直肠癌转移灶组织中表达的免疫组织化学染色图像

注：a图为Stathmin蛋白在结直肠癌组织中表达情况柱状图；b图为Stathmin蛋白在转移灶组织中表达情况柱状图；**为P<0.01,*为P<0.05

注：a图为Cathepsin B蛋白在结直肠癌组织中表达情况柱状图；b图为Cathepsin B蛋白在转移灶组织中表达情况柱状图；***为P<0.001)

本文免疫组化染色结果显示低分化结直肠癌肿瘤细胞核Stathmin蛋白阳性表达，表明Stathmin蛋白入核与肿瘤的恶性程度的升高密切相关，但Stathmin蛋白入核的具体分子生物学机制仍需进一步研究证实。Stathmin磷酸化和去磷酸化作用在细胞周期G2-M期发挥重要作用，活性形式的Stathmin需同时具备3个或4个磷酸化位点的激活，从而介导细胞周期的顺利进行。目前较多的学者认为，Stathmin的表达受到许多细胞因子的负性调节，如P53等。野生型的P53可以在转录水平抑制Stathmin蛋白的表达[19]，从而抑制细胞有丝分裂和细胞增殖活性，而突变型的P53对Stathmin的负性调控作用被解除，引起Stathmin蛋白的表达上调，导致肿瘤形成。由于P53基因的突变或缺失与大多数恶性肿瘤的发生发展及转移过程密切相关，尤其与结直肠癌发生发展及转移过程的关系更为密切[20]，本研究利用IHC对结直肠癌组织及其相应转移灶的肿瘤细胞中Stathmin蛋白的染色结果表明，Stathmin蛋白的表达上调可能与肿瘤细胞中突变型P53蛋白的表达上调有关。

组织蛋白酶(Cathepsin)是位于溶酶体内的一种半胱氨酸蛋白酶超家族，其主要生物学活性是参与生物体内某些前体蛋白的修饰。Cathepsin B是该蛋白酶超家族的重要成员之一，是由二硫键连接一条重链和一条轻链组成的分子量为29KD的二聚体，其重要的生物学功能之一是作为淀粉样前体蛋白分泌酶参与淀粉样前体蛋白的分解加工，这种淀粉样蛋白的活性与阿尔茨海默病的发生具有密切关系[9-10]，相关研究结果表明通过调控Cathepsin B蛋白的表达可以明显提高阿尔茨海默病患者的精神状态与记忆能力。近期Alapati等[21]研究表明Cathepsin B与UPAR协同调节了神经胶质瘤起始细胞的迁移活性，Cathepsin B 通过作用于JNK-MAPK信号转导通路中磷酸化的JNK以及MEKK1等蛋白的活性而促进神经胶质瘤起始细胞的迁移活性，与神经胶质瘤的发生发展关系密切。Ma等[22]通过免疫组化染色及荧光转染等方式对食管正常黏膜组织，食管癌前病变黏膜组织及食管鳞状细胞癌组织等的比较，揭示了Cathepsin B蛋白在正常食管黏膜组织中表达缺失，但是在食管癌前病变组织及食管鳞状细胞癌组织中Cathepsin B蛋白的表达均上调；与对照组相比，将转染Cathepsin B的正常食管上皮细胞接种入裸鼠体内引起食管鳞状细胞癌的发生，证实了Cathepsin B活性与食管鳞状细胞癌的发生发展密切相关。本文中不同分化程度的结直肠癌组织中Cathepsin B蛋白的表达均上调，并且在转移灶组织中的表达较高，与上述研究趋势一致。

目前关于Cathepsin B入核的分子生物学机制了解较少，有学者认为在肿瘤细胞发展及转移过程中，溶酶体内Cathepsin B的活性上调可以很好的为肿瘤细胞的前进清理道路，使肿瘤细胞更好的运动并且转移到合适的场所。大量研究结果均表明Cathepsin B转染后可以上调乳腺癌细胞，胰腺癌细胞，淋巴瘤细胞等的增殖活性以及侵袭转移能力；接种Cathepsin B阳性表达的肿瘤细胞更容易在裸鼠体内形成肿瘤，表明Cathepsin B在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用，可能与肿瘤的恶性程度及转移等生物学行为密切相关，这与本文的研究结果相符，在低分化的结直肠癌组织中Cathepsin B蛋白在肿瘤细胞核表达上调，但是在高分化及中分化结直肠癌组织中其阳性表达部位在肿瘤细胞膜或细胞浆。因此，Cathepsin B可能作为判断肿瘤患者临床分级与分期并指导患者预后评估的可靠蛋白。结直肠癌组织及其相应转移灶中Stathmin和Cathepsin B蛋白表达均上调，其表达情况与肿瘤的恶性程度关系密切，可能是监测肿瘤临床组织学分级的有用指标。

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