化学诱变筛选耐消泡剂的阿维菌素高产菌株

韩娜

摘要：本文采用实验法，运用亚硝酸诱变结合消泡剂来定向选育阿维菌素高产菌株，并得出了最终结论。

关键词：亚硝酸诱变 消泡剂 阿维链霉菌 发酵

本课题通过紫外诱变的手段，选育耐消泡剂的菌株，提高菌体本身对消泡剂的耐受，促进阿维菌素的合成，提高发酵单位。

1 材料与方法

1.1 菌种 出发菌株为实验室保存的菌株AV-9。

1.2 培养基 ①斜面培养基（%）：可溶性淀粉1.0，氯化钠0.05，硫酸按0.2，硫酸镁0.1，轻质碳酸钙0.3，琼脂粉1.5，pH：6.5～7.0。②种子培养基（%）：玉米淀粉3.0，黄豆饼粉0.8，花生饼粉1.0，酵母膏0.4，氯化钻0.0003，淀粉酶4U/g淀粉，pH：6.8～7.0。③摇瓶发酵培养基（%）：玉米淀粉15.0，豆饼粉2.5，酵母粉1.0，碳酸钙0.05，加入适量微量元素，淀粉酶4U/g淀粉，pH：6.8～7.0。

1.3 培养条件：斜面和摇瓶的培养条件均为温度28±1℃，相对湿度为45±5%。取0.1ml孢子液接入母瓶，220rpm培养40h，取1ml母瓶培养液接入发酵瓶中，培养10天后放瓶。

1.4 诱变筛选方法：①菌悬液的制备：将成熟斜面加50ml蒸馏水，刮下孢子，单层擦镜纸过滤备用。②诱变处理预试验：取过滤好的孢子液2ml与1M的醋酸缓冲液和0.1M的NaNO2溶液，按不同的比例混合，35℃保温不同时间进行处理，最后0.07M的Na2HPO4溶液终止反应。待诱变菌株分离后，每组选取一定数量的菌株接摇瓶进行效价测定，统计正变率，并进行诱变试验。③单菌落的培养：将处理好的孢子液进行一定量的稀释后，涂布双碟，双碟中加入4%的消泡剂，以1.3所述条件培养11天，选取单菌落制备成大试管斜面，接摇瓶进行效价的测定。④效价的测定：采用HPLC法，流动相：甲醇：水=90：10，色谱柱：4.6mm*250mm 5μm，检测波长：246nm，进样量：10μl，流速：1.0ml/min。根据出峰面积计算出B1效价。⑤耐消泡剂菌株的验证：经诱变选出的高单位菌株涂斜面，培养成熟后制备孢子液，取一定量的孢子液接入加4%消泡剂的摇瓶中，按④所述方法测定效价，同时以不加消泡剂的培养基作为对照。

2 结果与讨论

2.1 亚硝酸最适诱变剂量的确定。亚硝酸不同加量时菌落致死率、变异率及正变率的统计数据如下：

由图1可以看出，随着亚硝酸浓度的提高，致死率不断上升，在亚硝酸浓度为0.025时，致死率达到92.1%，此时的平均相对效价为112。其正变率最高，随着亚硝酸浓度的继续升高，致死率也在提高，但正变率却在降低，可能诱变剂剂量过大，会对菌种的伤害也越大。所以此试验选择亚硝酸浓度在0.025M，此时效价性状的正变率最高。

2.2 高单位菌株的选出。经诱变后，涂到加4%消泡剂的双碟上，培养10天后，加消泡剂后，菌落普遍偏黄，在正常的固体培养基中点种培养，菌落恢复了原来外观，选取200株菌落进行摇瓶实验，经初测复测得到5株效价明显提高的菌株。将这5株菌分别接至含4%消泡剂发酵瓶中，进行验证。效价情况如下：

由图2可知，加消泡剂后菌株的效价水平普遍比不加消泡剂的低，说明消泡剂的确对AV的合成有一定的不利影响，其中选出的9S-189号菌株，B1效价比出发菌株提高了14.1%，加消泡剂后比出发菌株对照提高了17.3%，此菌株是很有价值的菌株。

2.3 耐消泡剂菌株代谢特性的考察。将9S-189和AV-9两菌株接摇瓶培养，从第3天至第10天。开始每天放3瓶进行pH、总溏、效价等相关指标的检测，以考察其代谢特性。

从以上图表可以看出，新菌种pH一直维持在较高水平，糖代谢后的中间产物用于阿维菌素的合成，糖的利用率较高。

3 结语

综上所述，本实验得到的9S-189菌株对消泡剂的耐性的确有了一定的提高，并且此菌株在代谢特性上也发生了改变，使其更适应高消泡剂的环境，但此菌株还需要在大罐进一步验证。

参考文献：

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