柚皮素通过调控p38MAPK通路保护心肌细胞H9c2对抗阿霉素引起的毒性反应

马福义 杨迎春 黄擎轩 赵利

·论著·

柚皮素通过调控p38MAPK通路保护心肌细胞H9c2对抗阿霉素引起的毒性反应

马福义 杨迎春 黄擎轩 赵利

目的探讨柚皮素(naringenin，NAR)能否通过调控p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路保护心肌细胞H9c2对抗阿霉素(doxorubicin,DOX)引起的毒性反应。方法应用5 μmol/L DOX处理心肌细胞H9c2建立DOX心肌毒性损伤模型;CCK-8比色法检测细胞H9c2存活率；Western blot法测定p38MAPK蛋白表达水平;双氯荧光素染色荧光显微镜照相检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果在5 μmol/L1 DOX处理H9c2心肌细胞前，应用40 μmol/L NAR预处理24 h或应用5 μmol/L SB203580预处理60 min均能明显抑制DOX引起的心肌细胞毒性，使细胞H9c2存活率升高，细胞内ROS水平明显降低，并能抑制5 μmol/L DOX对磷酸化(p)p38MAPK表达的上调作用。结论柚皮素通过抑制p38MAPK通路保护H9c2心肌细胞对抗DOX引起的细胞毒性。

柚皮素；阿霉素；心肌毒性；p38MAPK；心肌细胞

柚皮素(naringenin,NAR)是柚皮甙的甙元，是一类天然黄酮类化合物，属二氢黄酮类化合物，广泛存在于枳实、化橘红、桃叶[1-3]等天然植物中，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等[4-7]作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。近年，NAR的心脏保护作用日益受到重视。值得注意的是，NAR能减轻抗癌药阿霉素(doxorubicin，DOX)引起的心肌毒性[8]。但是，NAR保护心肌细胞对抗阿霉素毒性引起的心脏毒性机制还不明确，其能否通过调控p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路保护心肌细胞对抗DOX引起的心肌毒性笔者尚未见报道。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，其主要的家族成员有三种，分别为细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、C-Jun N端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38MAPK，参与细胞增殖、分化、转化、凋亡的调节，并与炎症及其他多种疾病的发生机发展机制密切相关。其中p38MAPK作为细胞内重要的信号通路-MAPK家族中的一个成员，主要被细胞应激(比如紫外线、热休克等)激活[9]，主要参与应激条件下细胞的炎性反应和细胞凋亡过程。有报道指出，p38MAPK介导DOX引起心肌细胞毒性[10]。而NRG具有抑制MAPK活性的作用[11]。所以，我们推测NAR可通过调控p38MAPK通路对抗DOX引起的心肌细胞炎性反应。本文应用心肌细胞建立DOX引起炎症的细胞模型，探讨NAR是否能通过调控p38MAPK通路保护心肌细胞对抗DOX引起的毒性反应。

1 材料与方法

1.1 材料 Naringenin、阿霉素、SB203580、DCFH-DA购自Sigma Aldrich公司(USA)。细胞计数试剂盒8(cell counter kit-8,CCK-8)购自Dojindo Lab(日本)。DMEM-F12 培养基以及特级胎牛血清(FBS)购自Gibco BRL(USA)。抗p38、p-p38抗体购自Cell Signaling technology Inc (CST)。H9c2心肌细胞购自上海抚生实业有限公司。

1.2 细胞培养和与处理方法 H9c2心肌细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织，在37℃、5% CO2的条件下，培养于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。实验分为6组：(1)正常对照组；(2)DOX损伤组：5 μmol/L DOX 作用24 h；(3)NAR预处理+DOX损伤组：40 μmol/L NAR 作用H9c2心肌细胞24 h，撤去，用PBS洗两次，接着5 μmol/L DOX 作用24 h；(4)SB203580预处理+DOX损伤组：3 μmol/L SB203580作用H9c2心肌细胞60 min，撤去，用PBS洗2次，接着5 μmol/L DOX 作用24 h；(5)NAR组：40 μmol/L NAR 作用H9c2心肌细胞24 h；(6)SB203580组：3 μmol/L SB203580作用H9c2心肌细胞60 min。

1.3 CCK-8测定细胞存活率 H9c2 心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积大约80%时，根据实验需要进行不同的处理：(1)分别给予10、20、40、80 μmol/L不同浓度的NAR预处理24 h后撤去，PBS洗2次，再用5 μmol/L阿霉素培养24 h；(2)NAR预处理的不同时间(6、12、24、36和72 h)后撤去，PBS洗2次，再用5 μmol/L阿霉素培养24 h；每个处理因素设5个复孔。终止培养后，每孔加入10 μl CCK-8，轻摇，37 ℃孵育1.5 h，用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(OD)。取5孔OD值的平均数，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)= 处理组OD/对照组OD×100%，重复3次。

1.4 细胞内ROS含量的检测 H9c2心肌细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积约80%时，上述各实验组的不同处理因素完成后，PBS冲洗2次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育30 min。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，用ImageJ 1.41软件分析5个视野绿色荧光强度的平均值，再对每组的各样本进行统计分析

1.5 Western blot测定p38蛋白的表达 H9c2心肌细胞接种于60 mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗两次，加入细胞裂解液，4℃静置30 min，12000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭60 min，随后加入抗p38、p-p38抗体 (1∶1000)，4℃过夜，用TBST洗3次，10 min/次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

2 结果

2.1 NAR抑制DOX引起的心肌细胞毒性 5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞24 h可引起明显的细胞毒性，使细胞存活率降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在5 μmol/L DOX作用心肌细胞前，分别应用10、20、40、和 80 μmol/L柚皮苷(NRG)预处理24 h均可抑制DOX引起的细胞毒性，使细胞存活率升高(P<0.01),其中40 μmol/L NAR的保护作用最大。因此，本研究再观察40 μmol/L NAR在不同的预处理时间(6、12、24、36和72 h)的心肌细胞保护作用。40 μmol/L NAR可产生明显的抗细胞毒性作用，预处理24 h的作用最大。根据上述两项实验结果，本研究选用40 μmol/L NAR和24 h作为后续实验的有效保护浓度及有效预处理时间。见图1、2。

图1 不同浓度的NAR抑制DOX引起的心肌细胞毒性

图2 不同时间的NAR抑制DOX引起的心肌细胞毒性

2.2 NAR和p38MAPK抑制剂抑制DOX引起的心肌细胞毒性 40 μmol/L NAR 预处理细胞24 h或5 μmol/L SB203580 预处理细胞60 min可抑制DOX引起的细胞毒性，使细胞存活率升高。而单独40 μmol/L NAR 预处理细胞24 h或5 μmol/L SB203580 预处理细胞60 min不产生细胞毒性，表现为细胞存活率与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 NAR和p38MAPK抑制剂抑制DOX引起的心肌细胞毒性

2.3 NAR和p38MAPK抑制剂抑制DOX对磷酸化p38MAPK表达的上调作用 正常的H9c2心肌细胞具有一定水平的磷酸化(phosphorylated，p)p38MAPK蛋白表达。5 μmol/L DOX作用H9c2细胞60 min可使p-p38MAPK表达水平明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。但是，5 μmol/L DOX对总(t)p38MAPK蛋白表达无明显影响。在5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞前，应用40 μmol/L NAR预处理24 h可明显地抑制DOX对p-p38MAPK表达的上调作用(P<0.01)。40 μmol/L NAR本身对p-p38MAPK的基础表达无明显影响。5 μmol/L p38MAPK抑制剂抑制抑制 SB203580 预处理细胞60 min也和NAR一样能抑制DOX对磷酸化p38MAPK表达的上调作用。见图4、5。

图4 NAR抑制DOX对磷酸化p38MAPK表达的上调作用

图5 p38MAPK抑制剂抑制DOX对磷酸化p38MAPK表达的上调作用

2.4 NAR和p38MAPK抑制剂抑制DOX引起的心肌细胞氧化应激 为了探讨NAR、p38MAPK通路在HG引起的氧化应激反应中的作用，本研究在DOX作用H9c2心肌细胞前，应用p38MAPK抑制剂处理60 min，观察对HG诱导ROS生成的影响。图6显示，应用5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞24 h，可明显地增加ROS生成，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。在DOX处理心肌细胞前，分别应用3 μmol/L SB203580(p38MAPK抑制剂)或40 μmol/L NAR预处理能显著阻断DOX对ROS生成的促进作用，与HG处理组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果提示，NAR和p38MAPK抑制剂抑制DOX引起的心肌细胞氧化应激。见图6。

图6 NAR和p38MAPK抑制剂抑制DOX引起的心肌细胞氧化应激

3 讨论

DOX是一种蒽环类抗生素(anthracycline antibiotic)，临床上广泛用于抗恶性肿瘤比如白血病、淋巴瘤、乳腺癌等的广谱化疗药物。但是，由于它能引起心肌毒性[12]，故限制其在临床上的应用。研究证实，DOX诱发心肌毒性的机制是多方面的，其中氧化应激此外，钙离子平衡失调、细胞线粒体损伤、细胞凋亡、肾上腺功能失调被认为是一个重要的致病机制[13-15]。此外，心肌炎症与DOX心肌毒性也密切相关。本研究也观察到，DOX能引起H9c2心肌细胞产生氧化应激反应，表现为细胞内ROS水平升高。另方面，本研究证实，DOX能激活H9c2心肌细胞内p38MAPK通路；p38MAPK抑制剂(SB203580)能抑制细胞内ROS的生成，提示p38MAPK通路可能介导DOX引起的心肌细胞应激反应。

重要的是，本研究证实，NAR不仅抑制DOX激活的p38MAPK通路，同时也能控制DOX引起的应激反应和细胞毒性，表现为H9c2心肌细胞存在活率升高，使细胞内ROS明显降低，因此提示通过抑制p38MAPK通路可能是NAR保护心肌细胞对抗DOX诱发的细胞毒性和应激反应的重要机制之一。由于活性氧(ROS)能激活p38MAPK通路，而NRG具有消除ROS的作用，因此，NAR是否通过抑制DOX引起的ROS水平升高继而抑制p38MAPK通路尚需今后进一步探讨。

综上所述，本文证实NAR可通过抑制p38MAPK通路保护H9c2心肌细胞对抗DOX诱发的应激反应及细胞毒性，这为深入阐明NAR的心肌保护作用，特别是对抗DOX心肌毒性的作用机制提供了新的资料。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.010

074000 河北省高碑店市医院(马福义、杨迎春)；广东省化州市人民医院(黄擎轩)；福建省人民医院(赵利)

R 329.2+5

A

1002-7386(2014)15-2268-04

2014-01-10)