胃癌患者术中腹腔冲洗液MMP-2mRNA、MMP-14 mRNA检测的临床意义

王一波,谭玉林,孙亚伟,汤黎明

(1.江苏大学附属武进医院 普外科,江苏 常州,213017;2.南京医科大学附属常州市二院 普外科,江苏 常州,213002)

胃癌是消化道常见恶性肿瘤之一，其死亡率居高不下，而腹腔转移是胃癌最主要的复发转移方式之一，统计表明在进展期胃癌术后腹膜转移占40%～50%[1]。因此对胃癌腹腔转移进行早期诊断，是提高胃癌治疗效果的的重要途径。胃癌腹膜转移是由众多相关因素共同参与的过程，目前文献报道研究的相关因素有CK19mRNA、CK20 mRNA、COX-2mRNA、CEA mRNA等[2-3],而基质金属蛋白酶方面的研究少有报道，本文就采用实时荧光定量RT-PCR方法检测胃癌患者腹腔冲洗液MMP-2mRNA及MMP-14mRNA的表达,来探讨其在腹腔转移中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

经本院伦理学会批准选择临床及病理资料完整的江苏大学附属武进医院普外科2008年1月—2009年12月手术切除并经病理证实为胃癌患者98例。所有患者术前均未进行化疗，放疗或生物治疗,术前及术后病理学检查均诊断为胃癌。其中男60例，女38例；年龄23～82岁,46例年龄≥60岁，52例<60岁，平均(61.3±12.5)岁；肿瘤的原发灶大小、浸润深度、淋巴结转移均由病理观察确定，远处转移由病理学和临床联合确定。根据1990年世界卫生组织(WHO)肿瘤分化程度判断标准将胃癌患者分为高、中、低分化组,其中高分化组8例;中分化组50例,低分化组40例。胃癌分期采用2002年国际抗癌联盟制定的TNM分期标准,其中Ⅰ/Ⅱ期患者36例,Ⅲ/Ⅳ期患者62例。Borrmann分型为Ⅰ/Ⅱ型者54例,Ⅲ/Ⅳ型者44例。肿瘤直径≥5 cm者33例,<5 cm者65例。淋巴结转移阳性者71例,淋巴结转移阴性者巧27例。肿瘤浸润深度局限在浆膜层及浆膜内者犯66例,累及浆膜层外者32例。腹腔内转移转移者28例,无转移者70例。腹腔冲洗液阴性对照组为30例良性病变。胃癌免疫组织化学法对照组例数为20例，为良性胃病变黏膜组织。

标本采集：所有胃癌病例均采集术前腹腔冲洗液,向腹腔内注入无菌生理盐水100 mL,收集后TRIZOL法提取腹腔冲洗液标本中的总RNA,取少量RNA用于含量及纯度测定,其余分装后置-80 ℃保存待用。另收集30例良性病变病人腹腔冲洗液作为阴性对照。

1.2 材料与主要仪器

主要试剂: M-MLV反转录酶(Promega M1705),SunShineBioTM总RNA提取试剂(SunShineBio SN114),GoTaq qPCR Master Mix(promega A6001),Oligo dT18(SunShineBio),Random prime (SunShineBio),RNase Inhibitor (SunShineBio R0004),dNTP (SunShineBio D0056)。

1.3 实验方法

RT-PCR实验：从组织中提取总RNA。RT-PCR反应的实验操作步骤：取灭过菌且无核酸酶的0.2 mL PCR管,依次加入无核酸酶的双蒸水至总体积13.5 μL; 65 ℃保温5 min,然后冰浴5 min; 0.2 mL PCR管依次加入下列组分至总体积20 μL; 先在37 ℃保温1 h,然后70 ℃保温15 min; SYBR Green RT-PCR实验步骤：为减少干扰，每个cDNA样本都稀释10倍(5 μL cDNA+45 μL H2O)引物mix(引物的F和R在同一管中)，浓度各为2 μm。一个样本做3个复孔；反应体系：短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。反应条件: 95 ℃预变性10 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸31 s,共40个循环。熔解曲线分析。按照上述实验方法进行出来数据，阈值与Ct值由ABI Sequence Detection System软件自动得出。数据分析Real-time PCR输出的结果是Ct值，样本的MMP-2或MMP-14的Ct值-内参GAPDH的Ct值为△Ct,MMP-2或MMP-14的表达量即为2-vCt×1000。

引物设计基因名称引物序列片段长度Beta-actinF,5′-CAGTCGGTTGGAGCGAGCAT-3′R,5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′115 bpMMP-2F,5′GCTGCAACCTGTTTGTGCTGA-3′R,5′-TCCGCATGGTCTCGATGGTA-3′105 bpMMP-14F,5′-CATTGGAGGAGACACCCACTTTG-3′R,5′-CCAGGAAGATGTCATTTCCATTCAG-3′83 bp

2 结 果

2.1 Real-timeRT-PCR检测各目的基因在腹腔冲洗液中的表达

Real-timeRT-PCR检测各指标在腹腔冲洗液中的表达阳性率，见表1。

表1 MMP-2mRNA和MMP-14mRNA的表达

2.2 MMP-2mRNA表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较

通过统计分析可见，在胃癌腹腔液中MMP-2mRNA的表达阳性率随着肿瘤浸润深度的加深而显著增加(P<0.01); MMP-2mRNA表达的阳性率还与腹腔内是否转移有关,腹腔内转移的要明显高于无腹腔内转移者(P<0.01); 并与胃癌的大体类型有关,Borr3+Borr4型要明显高于Borrl+Borr2型(P<0.01),见表2。

表2 MMP-2mRNA表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较[n(%)]

2.3 MMP-14mRNA表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较

通过统计分析可见,在胃癌腹腔液中MMP-14mRNA的表达阳性率随着肿瘤浸润深度的加深而显著增加(P<0.01); MMP-14mRNA表达的阳性率还与腹腔内是否转移有关,腹腔内转移的要明显高于无腹腔内转移者(P<0.01); 并与胃癌的大体类型有关,Borr3+Borr4型要明显高于Borrl+Borr2型(P<0.01),见表3。

表3 MMP-14mRNA表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较[n(%)]

2.4 腹腔冲洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA之间表达的相关性

腹腔冲洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA表达水平进行相关性分析,由表4可知MMP-2mRNA及MMP-14mRNA在胃癌患者腹腔冲洗液中的表达呈正相关,(χ2=28.222,P=0.000,r=0.437)。

表4 腹腔冲洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA表达的相关性

3 讨 论

胃癌是中国人群中发病率和死亡率均占第一位的恶性肿瘤,腹腔转移是胃癌无法手术根治的主要原因之一,也是术后复发治疗失败的主要原因[4]。腹腔内脱落的癌细胞是形成腹腔转移的基础，其关键步骤是肿瘤细胞穿越由细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)组成的屏障是,Liu等[5]研究表明癌细胞可产生大量溶解酶降解基质或基底膜，这些溶解酶与癌侵袭转移能力显著相关，溶解酶系统由一庞大的蛋白溶解酶家族构成,被称为基质金属蛋白酶(MMPs),它是一组锌离子依赖性蛋白水解酶,因需要Ca2+、zn2+等金属离子作为辅助因子来发挥活性而得名[6],是一多基因家族，是人体内降解ECM的主要酶类,是一类与肿瘤浸润和转移密切相关的生物酶,MMPs可以通过降解ECM、调节细胞凋亡、增加细胞黏附能力、促进新血管生成来促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移,从而参与肿瘤演进等众多生理和病理过程[7]。Real-time PCR是近年来使用的一种检测技术,因高精确度、高灵敏度、污染少等优点已在生物医学、基础科研及临床医学中得到广泛应用。Kodera等[8]采用RT-PCR检测195例胃癌患者的腹腔冲洗液CEA mRNA及CK20 mRNA,结果CEA mRNA阳性率为22%,CK20mRNA阳性率为23%,均高于腹腔灌洗细胞学检查的阳性率(16%)。在各种分子生物学检测方法中,RT-PCR方法具有较高的灵敏度，从而使得胃癌腹腔微转移检测成为可能，在98例胃癌腹腔冲洗液中检测各目的基因的表达，定量范围宽广直观,是检测基因表达最理想的方法。本实验中,通过扩增产物的熔解曲线分析，可见窄而尖的熔点峰，表明实验中无污染，引物二聚体和非特异性扩增，产物纯度高,可见该反应体系完好,PCR扩增特异性高,可信度高，可用于统计学分析。

目前尚无公认的胃癌特异性肿瘤标志物或基因，这极大地降低了腹膜微转移检查的临床价值。所以目前寻找灵敏性与特异性更好的分子标志物，能够有效地提高腹腔内脱落肿瘤细胞的检出率成为关键的任务。本实验在MMPs中选取具有代表性的与胃癌临床病理关系密切相关的2种标志物基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-14(MMP-14),研究它们在胃癌腹腔转移中的作用机制。MMP-2基因位于染色体16q21,由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27 kb,MMP-2基因编码分子量约72 kd的酶原，经活化后水解为65 kd的活性形式。MMP-2是一种Ⅳ型胶原酶和明胶酶，可以降解细胞基质以及Ⅳ型胶原，形成局部溶解区以构成肿瘤细胞移动的通道[9]。其生理功能主要是参与伤口愈合,生殖以及生殖器官的复旧等。正常成人组织中它的水平较低，只有在系统接受一个刺激或病理状态下其水平才会升高[10]。

MMP-14属于膜型基质金属蛋白酶，膜型MMP分子均有前肽PRCGVPD高度保守序列、Zn2+结合位点、富含脯氨酸的铰链区及3个独特的插入序列。多数膜型MMP既是MMP的受体,也是MMP的激活剂,而且可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白。以往研究发现,在一些其他组织中,MMP-14是通过形成MMP-14/TIMP-2/pro-MMP-2三重复合物来激活MMP-2。

在本研究中，作者采用RT-PCR方法,对98例胃癌患者的腹腔冲洗液进行上述标志物mRNA表达的并行检测,并取30例良性病变腹腔冲洗液作为阴性对照。本实验结果显示,98例胃癌腹腔冲洗液中,MMP-2mRNA阳性率为42.9%(42/98),MMP-14mRNA阳性率为40.8%(40/98),而阴性对照组分别为1/30(3.33%)、2/30(6.67%)、0/30(0%)、1/30(3.33%),胃癌组远高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01),显示了良好的敏感性。

通过统计分析可见,在胃癌腹腔液中MMP-2、MMP-14的表达阳性率与胃癌生长方式有关，随着肿瘤浸润深度的加深而显著增加(P<0.01),亦随着浆膜类型的恶变而显著增加(P<0.05); 两种基因的mRNA表达的阳性率还与腹腔内是否转移有关，腹膜转移的要明显高于无腹膜转移者(P<0.01); 并与胃癌的大体类型有关,Borr3+Borr4型要明显高于Borrl+Borr2型(P<0.01)。本研究还进一步分析了胃癌腹腔液中MMP-2、MMP-14的表达与胃癌腹膜转移的关系。这2种标志物的表达随着肿瘤浸润深度的增加而显著增加，亦随着浆膜类型的恶变而显著性增加，说明这2种标志物与胃癌腹膜转移过程是密切相关的，提示该方法适用于胃癌腹膜转移的预测和亚临床转移的筛检。

本实验通过统计分析腹腔冲洗液中MMP-2和MMP-14之间表达的相关性,98例胃癌腹腔冲洗液中MMP-2和MMP-14表达正相关性(r=0.473,P<0.01); 说明MMP-2与MMP-14在胃癌的浸润转移过程中,具有正协同作用。

因此通过Real-timeRT-PCR方法检测胃癌患者腹腔冲洗液中目的基因mRNA来预测腹腔中的肿瘤细胞是可靠的,具有较高的敏感性和特异性，可及早发现常规检查所不能及的微转移灶。

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