异丙酚对大鼠脑损伤后神经细胞凋亡及脑组织Caspase-3表达的影响

孙正清 苏芳 盖成林 杨天德

·论著·

异丙酚对大鼠脑损伤后神经细胞凋亡及脑组织Caspase-3表达的影响

孙正清 苏芳 盖成林 杨天德

目的探讨异丙酚对大鼠脑损伤后神经细胞凋亡及脑组织Caspase 3蛋白表达的影响，为异丙酚的临床应用提供更为重要的科学依据。方法24只雄性Wistar 大鼠随机分为假手术组、冷冻伤后0.9%氯化钠溶液组和异丙酚组。异丙酚给药量为临床麻醉相关剂量(100 mg/kg)：冷冻伤后15 min腹腔注射异丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同剂量。采用颅骨外脑冷冻伤法，运用液氮冷冻器局部冷冻大鼠左侧顶部脑组织60 s制作冷冻伤即脑损伤模型。3组伤后24 h采用TUNEL法检测神经细胞凋亡,采用免疫组化法测定Caspase 3蛋白表达,并进行神经创伤评分。结果异丙酚组神经细胞凋亡与0.9%氯化钠溶液组比较降低(P<0.05)，但仍显著高于假手术组(P<0.01)。脑冷冻伤后24 h，0.9%氯化钠溶液组Caspase 3蛋白阳性表达水平较假手术组明显升高(P<0.01)，异丙酚组脑组织Caspase 3蛋白表达水平与0.9%氯化钠溶液组比较显著降低(P<0.05) 。脑冷冻伤后大鼠出现神经功能障碍，伤后24 h异丙酚治疗组神经创伤评分(NSS)明显低于0.9%氯化钠溶液治疗(P< 0.05)。结论临床麻醉相关剂量的异丙酚可以减轻脑损伤后延迟性神经细胞凋亡、促进神经功能的恢复。

异丙酚；脑创伤；凋亡；Caspase 3

颅脑损伤是一种较为严重复杂的脑创伤，是导致创伤患者伤残及死亡的重要原因。目前认为，脑损伤引起的急性期神经元死亡是以坏死为主，而继发死亡或迟发性死亡则以凋亡为主，前者发生在缺血后早期的中心区，后者多发生在缺血后的半影区，大约50%的神经细胞死亡是凋亡[1]。异丙酚作为一种常用的临床麻醉及重症患者镇静用药，随着对其药理特性的深入研究，其抗氧化及脑保护作用已逐渐被人们所认识。本研究采用脑冷冻伤这一经典的脑创伤模型，以异丙酚腹腔注射为干预，观察异丙酚对大鼠脑损伤后神经细胞凋亡及脑组织Caspase 3蛋白表达的影响，为异丙酚的临床应用提供更为重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性 Wistar 大鼠24只，体重230～250 g，由第三军医大学大坪野战外研所提供。随机分为假手术组：只切开头皮而未行冷冻伤处理；冷冻伤后0.9%氯化钠溶液组：冷冻伤后15 min腹腔注射0.9%氯化钠溶液5 ml/kg,0.5 h后再次追加相同剂量；异丙酚组：冷冻伤后15 min腹腔注射异丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同剂量。每组8只大鼠，3组伤后24 h进行神经创伤评分，之后处死动物，收集脑组织标本运用TUNEL技术进行凋亡检测,采用免疫组化法测定Caspase 3蛋白表达。

1.2 动物模型制备 按照参照文献[2]的方法制备动物模型。1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，待角膜及翻正反射消失后，俯卧位固定于立体定位仪上，碘氟消毒头部皮肤，沿正中切开头皮，分离骨膜，暴露左顶颅骨。将内盛丙酮的冷冻器直接浸泡入液氮中预冷，使冷冻器温度为液氮温度(-196℃)。将直径5 mm冷冻头垂直置于矢状缝左旁开5.5 mm为圆心的骨面上(冷冻头前缘至冠状缝)，冷冻60 s，造成左顶叶脑皮层的冷冻伤。手术室温度为25℃，术中电灯泡照射维持肛温为37～37.5℃。术毕自由进食水。

1.3 TUNEL法脑组织凋亡检测 冷冻伤后24 h,3组大鼠经1%戊巴比妥钠(60 mg/kg)深麻醉，剪开胸前臂，暴露心脏，经左室插入静脉针头直达主动脉，快速灌注肝素生理盐水，剪开右心耳放血，待流出液体清亮后(约需0.9%氯化钠溶液200 ml)，再以4%多聚甲醛溶液灌注45 min，约300 ml固定。迅即断头取脑，以冻伤灶为中心切取冠状脑组织块，4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h,移入30%蔗糖溶液置4℃脱水24 h至沉底。脱水后的标本于冰冻切片机预冷后做冠状面切片，每个标本切片6张，切好的标本放于冰箱中冷藏备用。TUNEL法检测程序，按照试剂盒(北京中山生物技术有限公司)使用说明书程序进行。TUNEL阳性细胞胞核中呈现棕黄色颗粒，阴性对照细胞核蓝染。每只大鼠选取一张脑切片，在400倍光镜下，随机取伤灶周围皮质10个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，总计1 000个细胞，计算出平均阳性率，即得AI(apoptosis index)。计算公式为：凋亡指数(AI)=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4 脑组织Caspase 3蛋白表达 取上述冷藏备用的冰冻切片,采用SABC法行Caspase 3蛋白免疫组织化学染色,选用北京中山生物技术有限公司生产的Caspase 3单克隆抗体，操作程序参照说明书进行．镜下观察胞浆有棕黄色颗粒者为阳性细胞。采用医学图像分析软件(Leica Qwin，德国)，进行分析。每组随机选择8张免疫组化染色片(免疫组化染色强度大致一致)，每张切片随机选取6个高倍视野，用图像分析软件对染色结果进行灰度分析，以平均灰度值代表蛋白表达水平：蛋白表达强则灰度值低，反之则高。

1.5 神经创伤评分(Neurological severity score，NSS) 参照Shapira等[3]制定的评分标准，从运动、反射、行为、功能测试等项目进行评分。观察在一个宽敞的房间中进行，观察者为非实验者，0分为最低分，表示未受损伤，25分为最高分，表示损伤最为严重。

2 结果

2.1 TUNEL法检测细胞凋亡结果 颅脑冷冻伤后24 h，TUNEL阳性神经细胞表现为细胞呈圆形、皱缩，核固缩，整个细胞着色深，细胞核内有较强的TUNEL阳性染色，而细胞浆内TUNEL阳性染色较少，为凋亡神经细胞的特点。主要位于冻伤灶周围。 假手术组脑组织及冻伤对侧未见或只见极少量散在的凋亡细胞，这可能是正常的生理死亡。在脑冷冻伤后24 h，异丙酚组冻伤灶周围神经细胞凋亡与0.9%氯化钠溶液组比较显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但仍显著高于假手术组(P< 0.01)。见表1、图1～3。

2.2 Caspase 3蛋白表达结果 Caspase 3蛋白表达阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。假手术组皮层Caspase 3染色阳性细胞较少。脑冷冻伤后24 h，0.9%氯化钠溶液组Caspase 3蛋白阳性表达水平(蛋白表达强则灰度值低，反之则高)较假手术组明显升高。阳性细胞表达主要来源于冻伤灶周围缺血半暗带区。异丙酚组脑组织Caspase 3蛋白表达水平与0.9%氯化钠溶液组比较显著降低，差异有统计学意义(P<0.05) 。见表1、图4～6。

表1 冷冻伤后24 h神经细胞凋亡数及脑组织Caspase 3蛋白表达灰度值 n=8

注：与假手术组比较，*P<0.05,#P<0.01;与0.9%氯化钠溶液组比较，△P<0.05

图1 脑冷冻伤后24 h0.9%氯化钠溶液组(TUNEL×400)图2 脑冷冻伤后24 h异丙酚组(TUNEL×400)图3 假手术组(TUNEL×400)

图4 假手术组Caspase-3(免疫组化×400) 图5 脑冷冻伤后24 h 0.9%氯化钠溶液组Caspase-3(免疫组化×400) 图6 脑冷冻伤后24 h异丙酚组Caspase-3(免疫组化×400)

2.3 神经创伤评分(NSS)结果 在冷冻伤后6 h 0.9%氯化钠溶液组NSS为5.25±1.03，随时间延长逐渐降低，伤后24 h异丙酚组明显低于0.9%氯化钠溶液组，差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组NSS为0，表示无神经功能障碍。见表2。

表2神经创伤评分

组别冻伤后6h冻伤后24h假手术组0.00±0.000.00±0.000.9%氯化钠溶液组5.25±1.033.00±0.76*异丙酚组—1.88±0.64#

注：与假手术组比较，*P<0.01;与0.9%氯化钠溶液组比较，#P<0.05

3 讨论

依据既往的报道,脑冷冻伤后皮质细胞凋亡于24 h达到高峰,并认为凋亡性细胞死亡促成了继发性脑损伤，脑冷冻伤模型也是一个简易的可用来研究创伤性脑损伤神经细胞凋亡的模型[4，5]。鉴于以上研究，本实验应用TUNEL技术观察脑冷冻伤后24 h的神经细胞凋亡情况。结果显示假手术组脑组织存在极少量散在的凋亡细胞，这可能是正常的生理死亡。颅脑冷冻伤后24 h(0.9%氯化钠溶液组)，皮质内神经细胞坏死主要位于冻伤灶中心区内，而表现为凋亡细胞特点的TUNEL阳性神经细胞主要位于冻伤灶周围,呈散在分布。上述特点的出现可能与以下述因素有关：脑冷冻伤后冻伤灶中央区的神经细胞很快就会因为缺血缺氧而坏死。而周围区是非直接遭受冻伤的部位，即所谓缺血半影区,缺血程度要轻于中央区，细胞处于相对静息垂死状态，离子传递受到抑制，能量合成减少，内环境改变较缓慢，细胞内钙离子缓慢升高，再灌注时自由基等在此明显堆积,内源性凋亡调节基因启动，导致细胞凋亡。

同时，我们也观察了异丙酚对脑冷冻伤后神经细胞延迟性凋亡的影响。研究结果显示，在脑冷冻伤后24 h，异丙酚治疗组冻伤灶周围神经细胞凋亡与0.9%氯化钠溶液治疗组比较显著降低，但仍显著高于假手术组。说明异丙酚对脑冷冻伤后神经细胞延迟性死亡有保护作用。目前创伤性脑损伤时神经细胞凋亡的机制尚不完全清楚。现有的资料表明，细胞凋亡相关调节蛋白如caspase家族在凋亡过程中起着必不可少的作用，特别caspase-3处于核心位置，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的关键因子[6],在本研究中，脑冷冻伤后24 h，生理盐水组Caspase 3蛋白阳性表达水平较假手术组明显升高，与既往研究结果[7]一致,异丙酚治疗组脑组织Caspase 3蛋白表达水平与0.9%氯化钠溶液组比较显著降低，说明异丙酚可能通过降低脑组织Caspase 3蛋白表达来发挥抗凋亡作用。近年来，有关异丙酚对缺血性脑损伤神经细胞凋亡的影响已有所报道。研究显示在脑缺血再灌注损伤异丙酚可以通过上调脑组织bcl-2表达、下调Caspase 3表达来发挥抗凋亡作用[8]。有关异丙酚对创伤性脑损伤的作用效应研究还较少。近期在创伤性脑损伤的离体模型的研究表明，异丙酚可剂量依赖性地减轻神经细胞的损伤,复合浅低温效果更显著[9]。国内王显望等[10]研究显示在自由落体脑创伤异丙酚可减轻神经细胞凋亡,支持本研究结果。我们的研究显示异丙酚可减轻脑冷冻伤后神经细胞延迟性凋亡，推测可能与异丙酚抗氧化、调节Ca2+平衡、减轻兴奋性氨基酸堆积进而影响凋亡调节蛋白如Caspase 3的表达有关。但确切的作用机制还需要进一步的研究。

中枢神经系统损伤时，行为学评分是对形态学评价药物治疗效果和神经功能恢复的重要补充。神经创伤评分(NSS)表明了鼠受伤后神经功能状态。文献报道，异丙酚可以改善缺血性脑损伤近期及远期的神经功能的恢复[11]。魏兴等[12]的研究发现，脑冷冻伤1 h NSS最高，之后渐下降，表明有部分神经功能自主恢复，麻醉药氯胺酮可以明显减轻伤后24 h NSS评分，促进了神经功能的恢复。本研究显示，临床麻醉剂量的异丙酚可明显减轻伤后24 h NSS评分，表明异丙酚可促进脑冷冻伤后神经功能的恢复。

在本研究中，因实验条件的限制，异丙酚以腹腔注射为干预，应用剂量为临床麻醉相关剂量。至于异丙酚影响脑损伤后继发损害的量效关系、治疗的时间窗和具体的作用机制，需要采用更为先进的给药方式，如微泵恒速给药或靶控输注技术，进一步深入探讨。

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10 王显望，杨天德，孙正清，等.异丙酚复合浅低温对大鼠脑创伤后神经细胞凋亡的影响.重庆医学，2005,34:1363-1364.

11 Bayona NA,Gelb AW,Jiang Z,et al.Propofol neuroprotection in cerebral ischemia and its effects on low-molecular-weight antioxidants and skilled motor tasks.Anesthesiology，2004,100:1151-1159.

12 魏兴，谢红，范圣登，等.氯胺酮对脑冷冻伤后自由基和脑水肿的影响.临床麻醉学杂志，2004,20:29-31.

TheeffectofpropofolondelayedneuronalapoptosisandCaspase3expressionafterbraininjuryinrats

SUNZhengqing,SUFang,GAIChenglin,etal.DepartmentofAnesthesiology,No.230HospitalofPLA,Liaoning,Dandong118000,China

ObjectiveTo explore the effect of propofol on delayed neuronal apoptosis and Caspase 3 expression after brain injury in rats in order to provide important scientific basis for clinical application of propofol.MethodsTwenty-four health male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,physiological saline treatment group after brain injury,propofol treatment group after brain injury.Propofol was injected intraperitoneally in a dose of 100mg/kg which was equivalent to clinical dose for general anesthesia,in which 50mg/kg propofol was administered ip 15min after brain freezing injury,and another 50mg/kg propofol was injected at 30min after the first injection.The freezing -induced brain injury models in Wistar rats were established by freezer (pre-cold in liquid nitrogen with the temperature at -196℃)-induced brain injury in Wistar rats on the left parietal side of skull of rat for 1 min.Apoptosis of neural cells was detected by TUNEL,and the expression of Caspase 3 protein in brain of rats was detected by immunohistochemistry,moreover,neurological severity score (NSS) was evaluated 24 hours after brain injury.ResultsThere was a significant difference in nerve cell apoptosis between propofol treatment group and physiological saline treatment group (P<0.05),furthermore,the apoptosis cells in both groups were significantly more than those in sham-operation group (P<0.01).24 hours after brain freezing injury,the expression levels of Caspase 3 protein in physiological saline treatment group were significantly higher than those in sham-operation group (P<0.01),however,which in propofol treatment group were significantly lower than those in physiological saline treatment group (P<0.05).After brain freezing injury,nerve function disturbance occurred in rats,24 hours after brain injury,the NSS in propofol treatment group were significantly lower than that in physiological saline treatment group (P<0.05).ConclusionPropofol in clinical dose for general anesthesia can reduce delayed neuronal apoptosis,promote recovery of nerve function after brain injury.

propofol；brain injury；apoptosis；Caspase 3

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.006

118000 辽宁省丹东市，中国人民解放军第230医院麻醉科(孙正清、苏芳、盖成林)；第三军医大学附属新桥医院麻醉科(杨天德)

杨天德，400038 重庆市，第三军医大学附属新桥医院麻醉科；

E-mail:31011@sina.com

R 971.2

A

1002-7386(2014)12-1777-04

2013-12-27)