肾母细胞瘤血管内皮生长因子与微血管密度检测及临床意义

王志超 邸玉琴 周辉 仲智勇 杨晓锋 李索林

·论著·

肾母细胞瘤血管内皮生长因子与微血管密度检测及临床意义

王志超 邸玉琴 周辉 仲智勇 杨晓锋 李索林

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在肾母细胞瘤血管生成中的作用。方法选取2006年1月至2012年1月河北医科大学第二医院小儿外科收治的30例肾母细胞瘤中保存完好的肿瘤组织(包括手术切除和活检)和血清，按美国肾母细胞瘤研究组(NWTSG)标准进行分期，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期5例，Ⅲ期18例，Ⅳ期3例。分为Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期2组。应用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中VEGF表达和MVD，采用ELISA 法检测各组患儿血清血管内皮生长因子，选取20例对照组患儿，并应用统计学方法进行分析。结果肾母细胞瘤VEGF及MVD水平在患儿不同年龄、性别间差异无统计学意义(P<0.05)；Ⅲ+Ⅳ期瘤体中VEGF表达及MVD均高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)；瘤体中VEGF表达与MVD呈正相关(r=0.672，P=0.00047)。结论瘤体中VEGF表达可反映肿瘤MVD；瘤体中VEGF表达和MVD以及血清中VEGF水平均可大致反映肿瘤分期；血清VEGF可能由瘤体分泌。

肾母细胞瘤；血管内皮生长因子；微血管密度；儿童；免疫组织化学

肾母细胞瘤又称为Wilms瘤，是儿童时期最常见的恶性实体肿瘤之一，多发生于3岁以下婴幼儿，常以无痛性腹部包块为主要就诊原因。正确判断临床分期对选择治疗方案及提高疗效至关重要。血管生成在肿瘤生长、转移过程中发挥着重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为血管内皮细胞的有丝分裂原，在多种恶性肿瘤新生血管的形成中发挥了重要作用，与肿瘤浸润性生长和转移密切相关[1]。因此，我们拟通过分析不同分期肾母细胞瘤组织与血清中VEGF表达及两者的关系，同时观察肿瘤局部微血管密度(micro-vessel density，MVD)，探讨VEGF在肾母细胞瘤发生和发展中的作用，为临床诊治提供指导和帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2006年1月至2012年1月河北医科大学第二医院小儿外科收治的30例肾母细胞瘤患儿，其中男18例，女12例；年龄1岁～5岁，平均年龄(2.3±1.6岁)。所有患儿均经活检或手术后病理证实为肾母细胞瘤，且所有标本获取前均未行化疗或放疗。以美国肾母细胞瘤研究组(NWTSG)标准进行分期，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期5例，Ⅲ期18例，Ⅳ期3例。分为Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组进行统计学分析。前者标本来源于术后病理，后者标本来源于活检。另选取20例非肿瘤(如肾外伤手术探查等)儿童的肾组织及血清标本做对照。切取无关疾病的标本获得医院伦理委员认可和通过。

1.2 方法

1.2.1 标本制备和处理：标本源自手术切除或活检所得肿瘤组织。取材时切取瘤体相对血供较丰富的实质部分，约5 mm×5 mm×5 mm大小，标本均以10%中性甲醛固定，石蜡包埋备用。同时留取30例患儿手术或活检前1 d清晨空腹静脉血各2 ml，置于血清分离管中，室温下血液自然凝固30 min后于3 000 r/min离心15 min，收集上清标本后置-20℃冰箱保存待测。

1.2.2 肿瘤组织中VEGF表达检测：①免疫组织化学法检测：兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体、S-P试剂盒均为河北博海生物工程开发有限公司提供。操作按S-P试剂盒说明书进行。每组均用PBS代替一抗作为阴性对照。已知阳性切片做阳性对照。②结果判定VEGF判定采用半定量记分法结合Berry的分级法：VEGF的阳性表达为胞浆着色，根据阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别记分：与阴性对照相同者记0分，淡黄者记1分，棕黄色者记2分，棕褐色者记3分。阳性细胞在观察细胞中所占比例：阳性细胞数≤10%记1分，11%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。两项分数乘积0～3分(-) ，4～5分为(+) ，6～7分为(++) ，8分以上为(+++)。≤3分为阴性，>3分为阳性。

1.2.3 3组血清VEGF水平检测：血清VEGF浓度采用双抗体夹心ELISA法测定。ELISA试剂盒购自美国R&D公司。实验步骤按照说明书指示操作，先将冻存血清标本室温融化，依次加样、孵育、洗涤，置于酶标仪在450 nm波长处读取吸光度OD值，根据OD值和标准曲线计算血清VEGF的浓度，比较各组间的差异。

1.2.4 3组组织中MVD检测：以3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，微波抗原修复，滴加CD34一抗，工作浓度1∶50，4℃过夜。滴加生物素标记二抗工作液，室温孵育10～30 min，PBS冲洗后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(streptavidin peroxidase，SP)，室温孵育10～30 min。DAB显色剂显色，冲洗，复染，封片，镜检。以已知阳性切片做阳性对照。根据Weidner方法：CD34标记的微血管判定标准是以与背景明显有别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连续，分支结构也作为一个血管计数。低倍镜(×100)选择肿瘤间质中MVD最多的区域(热点)，再转到中高倍镜(×200)下计数3个视野的微血管数，取其平均值作为MVD。

2 结果

2.1 肾母细胞瘤患儿VEGF、MVD与临床因素的关系 肾母细胞瘤VEGF表达及MVD水平在患儿不同年龄、性别间差异无统计学意义(P>0.05)，肾母细胞瘤(Ⅲ+Ⅳ期)VEGF阳性表达和MVD计数均显著高于(Ⅰ+Ⅱ期)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肾母细胞瘤瘤体中VEGF和 MVD值与临床相关情况分析

2.2 肾母细胞瘤瘤体及血清VEGF与MVD水平比较 瘤体组织及血清VEGF表达均高于对照组(P<0.05)，瘤体组织MVD高于对照组(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。见表2。

表2 2组VEGF与MVD的检测

组别VEGF[例(%)]sVEGF(ng/L)MVDⅠ+Ⅱ(n=9)5(55.6)551±22447.3±3.0Ⅲ+Ⅳ(n=21)19(90.5)*637±182*62.1±4.2*对照组(n=20)8(40.0)*#254±60*# 18.7±2.4*#

注：与Ⅰ+Ⅱ组比较，*P<0.05；与Ⅲ+Ⅳ组比较，#P<0.05

2.3 瘤体及血清VEGF与MVD相关性分析 经Pearson直线相关分析，在瘤体组织中VEGF表达与MVD呈显著正相关(r=0.672，P=0.00047)。但血清VEGF与MVD无相关性(r=0.095，P=0.619)。见图1、2。

图1 瘤体组织中VEGF表达与MVD呈正相关 图2 瘤体和血清中VEGF表达与MVD无相关性

3 讨论

肾母细胞瘤是多发于婴幼儿的高度恶性胚胎源性肿瘤。手术切除是治疗肾母细胞瘤的主要方法，由于起病隐匿，大部分患儿在就诊时瘤体巨大而无法一期手术切除[2]。随着新辅助化疗在肾母细胞瘤治疗中的应用，患儿的手术切除率及生存率得到了提高[3]。临床工作中如何对肾母细胞瘤的分期和治疗效果实施正确的监测和评估，对于提高其疗效和改善预后意义重大。

血管生成在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着举足轻重的作用，而血管生成受多个血管生成调节因子的调控[4]。VEGF作为目前已知的活性最强、专属性最高的血管生成因子，它选择性作用于血管内皮细胞特异性受体，主要发挥以下作用：诱导血管内皮细胞增殖和新生血管形成，增加血管尤其是微小血管通透性，使血浆大分子外渗；刺激内皮细胞产生PAS蛋白，从而促使渗漏到血管外区的血浆蛋白形成纤维蛋白凝块，为新生血管提供生长基质。

研究证明，VEGF在肾母细胞瘤的血管生成及肿瘤细胞的增殖过程中发挥着重要作用[5]。本研究通过对不同分期肾母细胞瘤瘤体及血清中VEGF的表达进行对比分析，发现临床分期越高，肿瘤组织中VEGF表达越高；而血清中VEGF水平随着临床分期的提高亦随之增高，这些结果表明肿瘤组织及血清中VEGF的表达均与肾母细胞瘤的临床分期密切相关。进一步研究发现，肿瘤组织中VEGF表达和血清中的VEGF表达呈正相关(P<0.05)，因而推测肾母细胞瘤可能自身合成并分泌VEGF，导致血清VEGF水平升高。有研究表明，许多恶性肿瘤都存在VEGF过量产生,病期越晚以及转移范围越广泛，血浆VEGF水平则越高[6]。肿瘤细胞分泌产生的VEGF可作用于相邻基质血管和淋巴管内皮细胞VEGF受体，促进内皮细胞分裂增殖，诱导血管和淋巴管新生，促进肿瘤生长转移[7]，这与本研究结果是一致的。因此认为可以通过检测血清VEGF辅助推断肾母细胞瘤大致临床分期，指导治疗。

本研究检测了肾母细胞瘤组织中的MVD，发现Ⅲ+Ⅳ期MVD显著高于Ⅰ+Ⅱ期，表明肿瘤分期越高，其新生血管就越多、血供越丰富，进而肿瘤生长就越快。同时，结果显示在小儿瘤体组织中VEGF与MVD呈正相关，考虑为肿瘤细胞在生长过程中不断分泌VEGF进而促使新生血管生成，新生的肿瘤血管加速肿瘤生长，在这种恶性循环的后期，肿瘤转移的概率将大大增加。因此，临床上应用抗血管生成剂打断这一循环链，以抑制肿瘤的生长。它是抗VEGF的人源化单克隆抗体，通过抑制VEGF受体，促进细胞凋亡，抑制增殖，阻止肿瘤进展。

由此可见，瘤体中VEGF表达可反映肿瘤MVD；瘤体中VEGF表达及MVD以及血清中VEGF水平均可大致反映肿瘤分期；血清VEGF可能由肿瘤分泌。

1 Glade Bender JL,Lee A,Reid JM,et al.Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of pazopanib in children with soft tissue sarcoma and other refractory solid tumors:a children’s oncology group phase I consortium report.J Clin Oncol,2013,31:3034-3043.

2 Green DM.The evolution of treatment for Wilms tumor.J Pediatr Surg,2013,48:14-19.

3 Sarin YK,Bhatnagar SN.Wilms’ tumor-roadmaps of management.Indian J Pediatr,2012.79:776-786.

4 Ghanem MA,van der Kwast TH,Molenaar WM,et al.The predictive value of immunohistochemical markers in untreated Wilms’ tumour:are they useful? World J Urol,2013,31:811-816.

5 Glade Bender J,Yamashiro DJ,Fox E,et al.Clinical development of VEGF signaling pathway inhibitors in childhood solid tumors.Oncologist,2011,16:1614-1625.

6 Mabeta P.Decreased secretion of vascular endothelial growth factor is associated with increased apoptosis in vascular tumor derived endothelial cells.J Physiol Pharmacol,2013,64:473-477.

7 Sandoval JA,Malkas LH,Hickey RJ.Clinical significance of serum biomarkers in pediatric solid mediastinal and abdominal tumors.Int.J.Mol Sci,2012,13:1126-1153.

ClinicalsignificanceofdetectionofVEGFandMVDinnephroblastoma

WANGZhichao*,DIYuqin,ZHOUHui*,etal.*DepartmentofPediatricSurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the significance of vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvessel density (MVD) in pathogenesis of nephroblastoma.MethodsThirty specimens of nephroblastoma tissues including surgical resection,biopsy and serum of patients with nephroblastoma hospitalized from January 2006 to January 2013 were enrolled in the study,and these specimens were divided into I～IV stage groups and the other two groups (Ⅰ+Ⅱand Ⅲ+Ⅳ) according to NWTSG criteria (National Wilms’ Tumor Study Group),in which there were 4 cases at stage,5 cases at Ⅱ stage,18 cases at Ⅲ stage,3 cases at Ⅳstage.The expressions of VEGF and MVD in tumor tissue were detected by immunohistochemistry.The other 20 cases of nonnephroblastoma were selected as control group.ResultsThere were no significant differences in the expression levels of VEGF and MVD in tumor tissue of children patients among different age groups and between males and females (P>0.05). The expression levels of VEGF and MVD in tumor tissue at Ⅲ+Ⅳ stage were significant higher than those at Ⅰ+Ⅱstage (P<0.05). The expression of VEGF in tumor tissue was positively correlated with that of MVD (r=0.672,P<0.01).ConclusionThe expression of VEGF in tumor tissue can reflect the condition of MVD;the expression of VEGF,MVD in tumor tissue and serum can reflect the tumor stageing; sVEGF may be secreted from the tumors.

nephroblastoma;vascular endothelial growth factors; microvessel density;children;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.003

项目来源：河北省科学技术研究与发展指导计划(编号：062761255)

050000 石家庄市，河北医科大学第二医院小儿外科(王志超、周辉、仲智勇、杨晓锋、李索林)，小儿内科(邸玉琴)

李索林，050000 河北医科大学第二医院小儿外科；

E-mail：lisuolin@263.net

R 692

A

1002-7386(2014)12-1769-03

2013-12-27)