半翼基因蛋白在实验鼠卵细胞联会复合体中的表达位置

张金文，杜春海，汪 冉（.河北医科大学第二医院血管外科，河北 石家庄 050000;.河北省景县人民医院外科,河北 景县 05500;.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000）

·论著·

半翼基因蛋白在实验鼠卵细胞联会复合体中的表达位置

张金文1，杜春海2，汪 冉3
（1.河北医科大学第二医院血管外科，河北 石家庄 050000;2.河北省景县人民医院外科,河北 景县 053500;3.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000）

目的探讨半翼基因（wings apart-like,Wapl）蛋白在实验鼠粗线期的卵细胞中联会复合体（synaptonemal complex，SC）的表达位置。方法从受孕18.5d胎鼠的卵巢中分离出处于粗线期的卵细胞，然后用抗-联合复合体蛋白2（anti-synaptonemal complex protein 2,SYCP2）和 抗-Wapl蛋白进行双免疫染色。结果SYCP2和Wapl在所检查粗线期的卵细胞位置重叠。结论Wapl可能是粗线期卵细胞SC的一部分。

合子；联会复合体；蛋白质类；大鼠

果蝇半翼基因（wingsapart-like,Wapl）蛋白在调解异染色质形成和染色体分离中起重要的作用[1-2]。在人和实验鼠体内，Wapl主要在睾丸内表达[3]。免疫细胞染色发现实验鼠Wapl位于粗线期的精母细胞联会复合体（synaptonemalcomplex，SC）中[3]。SC是一个减数分裂的特异结构，它由横丝（transversefilaments，TFs）相连的一对侧板（lateralelements，LEs）组成，它在第1次减数分裂的粗线期成熟。在第1次减数分裂的前期，SC精密的调整着一系列的反应，包括染色体配对、SC装配、同源染色体之间遗传物质互相交换（交叉重组）。这些事件确保了在第1次减数分裂同源染色体保持联接在一起并在保证它们准确地排列在赤道板上，以及随后向着相反的纺垂体移动。同源染色体识别错误或同源染色体遗传物质交换障碍必定会破坏同源染色体的分离和移动，导致产生非整倍体配子[4]。在许多减数分裂的基因突变的研究中，已证实SC的形成或解体与同源染色体正常分离有密切相关性[1，5-6]。已证实在缺乏联合复合体蛋白3（synaptonemalcomplexprotein3，SYCP3）实验鼠的卵细胞中，由于SYCP3缺陷的诱导致使减数分裂染色体错误隔离而产生非整倍体配子[7]。由于SC功能上的重要性，我们研究了雌性实验鼠生殖细胞中Wapl可能存在的位置，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验鼠：C57BL/6N实验鼠（BarHarbor,ME，证号129P2/01aHsd）喂养在标准的设施内，室温控制在22℃，12h光照，12h黑暗，水和食物摆放在实验鼠能自由接触的位置。2只成年雌鼠和1只雄鼠放入一个笼子内，标记有阴道精斑雌鼠，于18.5d从胎鼠中采集处于粗线期的卵细胞。

1.2 胎鼠卵巢粗线期卵细胞的采集：采用“dry-down”技术，在受孕后18.5d，从雌性胚胎收集卵巢[8]。解剖出胚胎的卵巢放入PBS液体中，转移到hypo-extractionbuffer液体25～30min。每对卵巢放入25μL100mmolSucrose器皿中,用注射器针头捣碎，10μL悬浮液滴到玻璃载物片，该玻璃载物片事先用新鲜配制的1%PFA液体浸泡。玻璃载物片立即放入湿热箱让其慢慢晾干2～6h，然后洗涤玻璃载物片用0.04%KodakPhotoFlo液体，空气晾干玻璃载物片，在相差显微镜下，粗线期的生殖细胞呈现为体积大而蓬松的形状。晾干的玻璃载物片-20℃或-80℃储存直到下一次应用。

1.3 免疫荧光染色：粗线期的卵细胞，在37℃的条件下分别与第一抗体及第二抗体孵化1h，随后，在37℃的条件下用PBS洗刷。这些卵细胞与2种第一抗体多克隆荷兰猪抗-SYCP2（1∶500稀释）[9]和多克隆荷兔抗-Wapl（1∶400稀释）[3]共同孵育，然后，按1∶1 200稀释affinity-purifiedCy3-conjugated兔抗鼠IgG（JacksonImmuno-ResearchLaboratories,Suffolk,UK）和1∶100稀释猪抗兔异硫氰酸荧光素（DakoCytomation,Glostrup,Denmark）。核染色质用DAPI（400μg/L;SigmaD-9542,Sigma-AldrichInc;St.Louis,MO,USA）进行染色2min，用PBS迅速洗涤卵细胞，以抗褪色剂（MolecularProbes;Eugene,OR,USA）封闭玻璃载物片。利用显微镜（LeicaDMRA2andDMRXA：LeicaMikroskopieunderSystemGmbH;Wetzlar,Germany）和萤光显微镜（×1 000）以及照相机（C4742-95（HamamatsuPhotonicSystems;Hamamatsucity,Japan）记记下卵细胞的形态变化并用OpenlabTMsoftwareversion3.1.4（ImageProcessing&VisionCompanyLimited;Coventry,UK）进行分析。

2 结 果

Wapl和SYCP2（哺乳类动物卵细胞中SC的一个标志蛋白）在粗线期的卵细胞中处于重叠位置（图1）。

图1Wapl与SYCP2在实验鼠粗线期的卵细胞SC上呈重叠分布（免疫组织化学 ×1 000）
Figure1ColocalizationofWaplwithSYCP2ontheSCinthemousepachyteneoocytes（immunohistochemistry×1 000）

A.伸展和固定的卵细胞染色体被抗-SYCP2染成红色；B.抗-Wapl呈绿色;C.A+B合并
A.Chromosomalspreadofoocytesatpachynemafixedandstainedwithanti-SYCP2 （red）;B.anti-Wapl（green）;C.mergedimage

3 讨 论

Wapl最早是在果蝇体内发现的，其所编码的蛋白可调节异染色质的结构，突变的Wapl基因在异染色质区域阻止了姐妹染色单体的正常靠近和并列，但不影响染色体的凝集和分离。Wapl基因在有丝分裂的异染色质区域对于维持姐妹染色单体的粘连起着非常重要的作用，同时也调节染色体的功能[1-2]。目前，在人类约有20%不孕症及胚胎死亡是由卵细胞染色体非整倍体引起。0.3%新生儿患有智能障碍，如先天愚型儿，也是由卵细胞染色体异常所引起，但其发病机制还不十分清楚。已证实实验用鼠的Wapl位于粗线期的精母细胞联会复合体。且已证实实验用鼠的Wapl位于粗线期的精母细胞SC[3]。目前已证实SC的形成或解体与同源染色体正常分离有密切相关性[1，5-6]。在缺乏SYCP3的条件下，实验鼠的卵细胞由于SYCP3缺陷的诱导致使减数分裂染色体错误隔离而产生非整倍体配子[7]。有研究[10-11]证实人类Wapl是一种黏性结合蛋白质，它能促进姊妹染色单体在有丝分裂前期分离。Wapl在Hela细胞的消耗能导致早中期类的细胞堆积，这些细胞染色体的姊妹染色单体极少分离，相反，Wapl的过度表达能引起姊妹染色单体在成熟前期分离，它提示Wapl在减数分裂中同黏性结合蛋白质（染色体精确分离所必须的蛋白质）一样起着调解染色体分离的作用。在本研究中我们首次证实在实验鼠卵细胞中Wapl与SC重叠分布，与在粗线期的精母细胞的Wapl与SC重叠分布相一致[3]。这些结果预示Wapl参与减数分裂中染色体的组装过程。

Wapl表达异常可能干扰实验鼠生殖细胞正常分裂与成熟，Wapl与SC的确切的分子结构关系以及Wapl在人类不孕不育疾病中发病机制有待以后进一步研究。

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（本文编辑：赵丽洁）

EXPRESSIONOFWINGSAPART-LIKEPROTEINLOCALIZATIONONSYNAPTONEMALCOMPLEXINMOUSEOOCYTES

ZHANGJinwen1,DUChunhai2,WANGRan3
（1.DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofSurgery,theJingxianRenminHospital,HebeiProvince,Jingxian053500,China;3.Departmentof
ClinicalLaboratory,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China）

ObjectiveInordertoanalyzethecorrelationofthewingsapart-like（Wapl）proteinandthesynaptonemalcomplex（SC）ofpachyteneoocytes.MethodsThepachyteneoocyteswereisolatedfromfoetalmiceovariesat18.5danddoubleimmunostainedwithanti-synaptonemalcomplexprotein2 （SYCP2）andanti-Wapl.ResultsInthepachyteneoocytesexamined,mouseWaplwascolocalizedwithSYCP2ontheSC.ConclusionWaplmaybeapartofpachyteneoocyteSC.

zygote；synaptonemalcomplex；proteins；rats

2014-01-08；

2014-04-02

张金文（1960-），男，河北景县人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学博士，从事血管外科疾病诊治研究。

R349.64

A

1007-3205（2014）05-0527-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.011