新型胰岛素增敏剂的合成及其生物活性评价*

宋云龙，何新华，樊士勇，史卫国，贾红心，仲伯华

(1.中国人民解放军 军事医学科学院 毒物药物研究所，北京 100850;2.中国人民解放军 第二炮兵总医院 药学部,北京 100088)

·研究论文·

新型胰岛素增敏剂的合成及其生物活性评价*

宋云龙1,2，何新华1，樊士勇1，史卫国1，贾红心1，仲伯华1

(1.中国人民解放军 军事医学科学院 毒物药物研究所，北京 100850;2.中国人民解放军 第二炮兵总医院 药学部,北京 100088)

以川芎嗪为结构单元，与噻唑烷二酮类降糖药物的药效团组合，设计并合成了一个新的胰岛素增敏剂——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ),其结构经1H NMR和MS表征。体外活性测试结果表明，Ⅰ在用药量为1×10-5mol·L-1时对PPAR-γ的激动活性与吡格列酮相当；体内生物活性测试结果表明，Ⅰ有抑制血糖升高的倾向,有一定的血管内皮细胞保护作用。

噻唑烷二酮；胰岛素增敏剂；激动剂；合成；生物活性

以吡格列酮(Pioglitazone)、罗格列酮为代表的格列酮类药物是PPAR-γ特异性高亲和力配体，通过提高骨骼肌和脂肪细胞对葡萄糖吸收和降低肝糖的输出来提高细胞对胰岛素的敏感性，改善胰岛素的抵抗状态，从而全面兼顾糖尿病高血糖、高胰岛素血症、胰岛β细胞受损、胰岛生理功能失活这4个病变环节，超越单一控制血糖的局限，全面控制糖尿病。但是,由于具有水肿、体重增加以及心血管方面的副作用[1-2]，罗格列酮已从欧盟市场撤出，吡格列酮的应用也受到限制。

PPAP-α激动剂可以促进肝脏脂类的氧化代谢，与PPAR-γ激动剂有协同作用。因此，PPAR-α/γ双重激动剂能较好地解决PPAR-γ激动剂带来的病人体重增加等问题，列扎类化合物muraglitazar,Tsaglizazar及噻唑烷二酮类化合物KRP-297就是这样一类药物，它们可以改善肝脂代谢失调和提高对胰岛素的敏感性，但是因为在Ⅲ期试验阶段中显示具有心血管方面的副作用或者能够诱导小鼠体内肿瘤的产生，该类药物均终止了研发。克服胰岛素增敏剂类药物的副作用，是该类药物研发的瓶颈。

川芎嗪(四甲基吡嗪,1)对心血管系统有多方面的药理作用,包括保护血管内皮细胞[3]、抗血小板聚集[4-5]、清除自由基[6-7]等。

通过对噻唑烷二酮类化合物的逆合成分析，本文以1为结构单元，与噻唑烷二酮类降糖药物的药效团组合，设计并合成了一个新的噻唑烷二酮类化合物——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ,Scheme 1),其结构经1H NMR和MS表征。并对其生物活性进行了评价。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

JNM-ECA-400400MHz型超导核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；API3000型电喷雾质谱仪。

(Z)-2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-亚甲基]-苯甲酸甲酯(7)和2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-苯甲酸甲酯(8)按文献[8]方法合成；硅胶GF254和柱层析硅胶(200目～300目，300目～400目)，青岛海洋化工厂；其余所用试剂均为分析纯，溶剂按常规方法经干燥处理。

1．2 合成

(1)2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(2)的合成

在单口烧瓶中依次加入17.2g(53mmol)，N-溴代丁二酰亚胺(NBS)12.0g(53mmol)，四氯化碳120mL及催化量过氧化苯甲酰，搅拌下光照回流反应12h。浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3]纯化得淡黄色液体24.0g，收率35%。

(2)N-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-甲基]-邻苯二甲酰亚胺(3)的合成

在反应瓶中依次加入24.0g(18.7mmol)，DMF 50mL和邻苯二甲酰亚胺钾盐5.0g，搅拌下于90℃反应5h。用水洗涤、无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得34.8g，收率92.3%。

(3)2-氨基甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(4)的合成

在反应瓶中加入34.8g和乙醇100mL,搅拌使其溶解；加入水合肼3mL，回流反应至终点(随反应进行有白色固体产生)。过滤除去不溶物，滤液浓缩后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=2∶1)纯化得黄色油状液体42.6g，收率61%。

(4)2-甲氧基-5-甲酰基苯甲酸甲酯(6)的合成

在反应瓶中依次加入2-羟基-5-甲酰基苯甲酸(5)5.0g(30mmol)，三苯基磷15.6g(60mmol)，甲醇2.0g(62.5mmol)及THF 100mL,搅拌使其溶解；氮气保护，冰浴冷却至0℃，缓慢滴加偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)9.2mL(60mmol)的THF(80mL)溶液(0.5h)，滴毕，于室温反应10h。浓缩后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=1∶1)纯化得白色固体65.5g，收率94.8%。

(5)Ⅰ的合成

在反应瓶中加入80.41g(1.5mmol)和DMF 30mL,搅拌使其溶解；依次加入三乙胺0.45g(4.5mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)0.57g(3mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)0.20g(1.5mmol)，于室温反应10min。加入40.23g(1.5mmol)，于室温反应8h。减压蒸除DMF，加50mL水，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后经硅胶柱层析[洗脱剂：V(DCM)∶V(MeOH)=10∶1]纯化得白色固体0.33g，收率54%；1H NMRδ: 12.0(s,1H,CONHCO),9.290(t,J=4.4Hz,1H,CONH),7.161～7.838(m,3H,ArH),4.913(dd,J=4.8Hz,8.8Hz,1H,b-H),4.586(d,J=4.4Hz,2H,a-H),3.994(s,3H,OCH3),3.346(dd,J=8.4Hz,14.0Hz,1H,c-H),3.169(dd,J=8.4Hz,14.0Hz,1H,c-H),2.456～2.505(m,9H,ArCH3)；ESI-MSm/z: 415.5{[M+H]+}。

1．3 生物活性测试

(1)PPAR-γ的受体激动活性

[9]方法进行PPAR-γ的受体激动活性测试。阳性对照为吡格列酮，溶剂对照值为1，实验结果用相对激活倍数表示，值越大激活能力越高。

(2)葡糖糖耐量实验(OGTT)

受试动物: 昆明种小白鼠18g～22g,雌雄各半,饲用商业饲料,任意饮水。在实验室适应3d后,取体表无损伤、一般情况好、反应灵活的小鼠用于实验。

受试药物: 受试化合物均以生理盐水及吐温配成混悬液，给药体积0.2mL/10g,给药量10mg·kg-1,灌胃给药,每天一次。

葡萄糖耐量实验方法[10]：取体健小鼠随机分为以下各组(10只/组,雌雄各半),生理盐水对照组,吡格列酮组和Ⅰ组,各组给药剂量均为10mg·kg-1,连续给药7d,至末次给药后当晚起,小鼠禁食约12h,次日分别在糖负荷前和糖负荷后1h和2h,经小鼠尾静脉取血,血糖仪测定糖负荷前后的血糖浓度。

(3)胰岛素耐量实验

按1.3(2)取小鼠分为3组(10只/组,雌雄各半),连续给药14d。至末次给药当日晚至次晨空腹约12h,经眼眶静脉丛取血后,各组立即予以胰岛素负荷0.2μ·kg-1皮下注射,注射1h和2h后,取血样,按上述方法测定胰岛素负荷前后小鼠血糖的变化。

(4)血管内皮细胞保护实验

药液配制：以DMSO为溶剂，配置c(Ⅰ)为100mmol·L-1;使用c(Ⅰ)：(0，0.1，1，10，100)×10-6mol·L-1，储存于-20℃备用；过氧化氢的配制:先吸8.3μL 30%H2O2溶液加到1mL灭菌去离子水中，从中取10μL加入到2mL培养基中，配成4×10-4mol·L-1的浓度溶液。使用浓度2×10-4mol·L-1，作用4h。

细胞存活实验(CCK-8实验)实验方法:以3×103细胞/孔的起始浓度在96孔板中接种HUVEC细胞，每孔加入100μL RPMI 1640培养基。于37℃细胞培养箱中培养24h；每孔分别加入不同浓度[(0，0.1，1，10，100)×10-6mol·L-1]药液，每个浓度做6个复孔。同时设不加药液的对照孔。药液处理12h后，加入2×10-4mol·L-1H2O2，作用4h 后，吸出培养基，并用新鲜的培养基洗2次；每孔加入100μL新鲜的无血清培养基(含1/10CCK8试剂)，于37℃孵育4h。用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；在450nm测定吸光度(OD)，计算细胞存活率[细胞存活率/%=(OD药剂-OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)×100%]。

2 结果与讨论

2.1 Ⅰ的生物活性

(1)PPAR-γ的受体激动活性

PPAR-γ受体激动活性初步评价结果见表1。由表1可见，Ⅰ在用药量为1.0×10-5mol·L-1时对PPAR-γ受体的激活作用与阳性对照吡格列酮相当。

Ⅰ 的耐糖和耐胰岛素实验结果分别见表2和表3。由表2可见，Ⅰ对糖负荷的影响虽然与对照组比较无显著性差异,但是其抑制血糖升高的倾向是显而易见的。

由表3可见，在胰岛素负荷的试验中,2h时对照组的血糖值已经回升,而Ⅰ与Pioglitazone还有明显降血糖的作用,说明Ⅰ能明显加强和延长外源性胰岛素的降血糖作用。因此可以初步肯定,Ⅰ具有一定的降血糖活性,且可能具有提高组织对胰岛素敏感性的作用。

表1 PPAR-γ受体激动活性Table1 In vitro PPAR-γ activities of PPAR-γ agonists

Ⅰ的细胞存活实验结果见表4。由表4可见,Ⅰ在用药量为(0.1～100)×10-6mol·L-1时未表现明显的细胞毒作用。

Ⅰ的内皮细胞保护作用实验结果见表5。由表5可见，Ⅰ在高浓度(1.0×10-4mol·L-1)对H2O2所致细胞毒性有一定的保护作用。

表2 Ⅰ的耐糖实验结果Table2 Oral glucose tolerance test in mice(x±SD,n=10)

表3 Ⅰ对小鼠胰岛素负荷后血糖的影响(x±SD,n=10)Table3 Effect of Ⅰ on blood glucose under insulin load in mice(x±SD,n=10)

表4 Ⅰ的细胞存活实验Table4 Cell viability assay of Ⅰ

表5 Ⅰ的内皮细胞保护实验(x±SD,n=10)Table5 Protective effect of human umbilical vein endothelial cells of Ⅰ(x±SD,n=10)

3 结论

合成了一个新的噻唑烷二酮类化合物——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ)。PPAR-γ的受体激动活性初步评价结果表明，Ⅰ 在用药量1.0×10-5mol·L-1时对PPAR-γ受体的激活作用与阳性对照吡格列酮相当。葡糖糖耐量实验结果表明：Ⅰ有明显抑制血糖升高的倾向和能明显加强和延长外源性胰岛素的降血糖作用。细胞存活实验结果表明：Ⅰ在(0.1～100)×10-6mol·L-1内未表现明显的细胞毒作用；内皮细胞保护作用实验表明：Ⅰ在高浓度(1.0×10-4mol·L-1)时对H2O2所致细胞毒性有一定保护作用。

Ⅰ兼有降血糖作用和内皮细胞保护作用，在一定程度上可以克服传统PPAR-γ激动剂在心血管方面的副作用，对于Ⅱ型糖尿病的治疗具有潜在应用价值。

参考文献

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SynthesisandBiologicalEvaluationofaNovelInsulinSensitizerwithNaturalScaffolds

SONG Yun-long1,2, HE Xin-hua1, FAN Shi-yong1, SHI Wei-guo1, JIA Hong-xin1, ZHONG Bo-hua1

(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Science of PLA，Beijing 100850，China;2.Department of Pharmacy,the Second Artillery General Hospital of PLA,Beijing 100088,China)

A novel insulin sensitizer,5-[(2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl]-2-methoxy-N-[(3,5,6-trimethyl-pyrazin-2-yl)methyl]benzamide(Ⅰ),was designed and synthesized by combining the fragment of tetramethylpyrazine with pharmacophore of TZDs.The structure was characterized by1H NMR and MS.Ⅰ showed approximately equal PPAR-γagonist activity to Pioglitazone at 1.0×10-5mol·L-1invitro.Ⅰ could protect the vascular endothelial cells and it can be expected that the cardiovascular side effects may be reduced.

TZDs;insulin sensitizer;agonists;synthesis；biological evaluation

2014-04-14

国家新药创制重大专项基金资助项目(2012ZX09301003-001-004)

宋云龙(1984-)，男，汉族，山东日照人，博士研究生，主管药师，主要从事药物合成的研究。Tel.010-66343013，E-mail: songyunlong12@163.com

仲伯华，研究员，Tel.010-66931693，E-mail: bohuazhong@yahoo.com

O626；O621.3

A

1005-1511(2014)05-0596-05