Resolvin D1对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

段丽娜 路红涛

急性肺损伤 (acute lung injury, ALI) 是各种原因导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全[1]。其病理生理机制包括氧化反应与抗氧化反应的失调和炎症反应与抗炎反应的失调[2]。尽管目前有多项治疗方法，但是尚无有效的干预措施，病死率极高[3-4]。因此急需寻找有效的药物治疗急性肺损伤。

Resolvins为内源性抗炎物质Omega-3多不饱和脂肪酸(EPA和DHA)的代谢产物。EPA和DHA可分别产生E-系列(Resolvin E)和D-系列(Resolvin D)的Resolvins。 多个研究显示Resolvin D1(RvD1)具有可缓解小鼠模型变应性气道炎症等多种抗炎作用[5-7]，然而尚未见到RvD1对急性肺损伤保护作用的相关研究。因此我们假设RvD1对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小鼠急性肺损伤具有保护作用，并进一步探讨可能的机制。

材料和方法

一、主要试剂

雄性BALB/c小鼠21只，体质量20～25 g由西安交通大学医学院实验中心提供。 RvD1购于Cayman公司。丙二醛(malondialdehyde, MDA)测试盒购于南京建成生物工程研究所。LPS购于Sigma公司。IL-10、IL-6 ELISA检测试剂盒是由武汉博士德生物工程有限公司提供。

二、实验方法

1. 实验模型和分组： BALB/c小鼠随机分3组(7只/组)。利用10%水合氯醛麻醉小鼠(0.3～0.4 ml/kg)。①对照组，气道内滴注PBS 60 μl；②LPS模型组：气管插管，气道内滴注LPS(100 μg/60 μl); ③RvD1组：在气道内滴注LPS 30 min前，尾静脉注射RvD1(600 ng(100 μl)/小鼠)。LPS气道滴注6 h后处死小鼠。小鼠均在西安交通大学医学院动物中心SPF级动物房饲养。

2. 收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF): 造模6 h后将小鼠麻醉，股动脉放血处死，利用0.6 ml预冷的PBS进行支气管肺泡灌洗(2次/只)，肺泡灌洗液的回收率达80%。BALF在4 ℃，800×g，离心10 min。分别收集沉淀和上清，BALF上清液在-80 ℃保存备用。离心后的细胞沉淀用PBS重新重悬，利用细胞计数板进行细胞计数。取细胞沉淀涂片，凉干后行瑞氏染色，进行中性粒细胞计数。

3. 肺组织病理学检查: 取出左肺组织放入10%甲醛固定，固定后进行脱水，透明，石蜡包埋后切片(4 μm)，进行苏木素-伊红( HE )染色，光镜观察肺组织病理学改变。

4. 肺组织内MDA含量测定： 肺组织内MDA浓度测定采用南京建成生物工程公司试剂盒，严格按试剂盒说明书进行操作。

5. BALF中IL-10、IL-6浓度检测： BALF上清中IL-10、IL-6的浓度利用ELISA方法检测，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

三、统计学方法

所有数据以M±SD形式表示。采用SPSS13.0软件进行正态性检测，方差齐性检验。组间比较采用单因素方差分析，非正态分布数据经正态转换后再进行统计学处理，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、RvD1对肺组织病理改变的影响

如图1所示，与对照组相比，气道内滴注LPS的小鼠肺组织病理显示，肺泡及肺间质大量出血，组织水肿，肺泡间隔增厚，正常的肺组织结构明显被破坏。而应用RvD1预处理(在LPS给药前30 min)小鼠后上述改变被明显减轻。

对照组

LPS模型组

Resolvin

二、RvD1对小鼠肺组织浸润炎症细胞数的影响

如图2所示气道内滴注LPS 6 h后，(图2A) BALF内炎症细胞数显著升高 (P<0.01，与对照组相比)，(图2B)中性粒细胞计数显著升高(P<0.01，与对照组相比)。而应用RvD1预处理后，可显著减轻LPS诱导小鼠急性肺损伤炎症细胞的浸润。

注：A: BALF中炎症细胞总数计数；B: BALF内中性粒细胞数；*P<0.01 vs. 对照组; #P<0.01 vs. LPS模型组

三、RvD1对小鼠肺组织MDA浓度的影响

如图3所示，MDA为体内脂质氧化损伤的标志。与对照组比较， LPS模型组MDA的浓度明显升高(P<0.01)。而而应用RvD1预处理后，可显著抑制LPS诱导的MDA浓度升高。

注：*P<0.01 vs. 对照组; #P<0.01 vs. LPS模型组

四、RvD1对小鼠肺组织分泌细胞因子的影响

如图4所示，气道内滴注LPS 6 h后， BALF中IL-6(图4A)的浓度与对照组相比显著升高(与对照组相比P<0.01)，保护性细胞因子IL-10 (图4B) 较对照组有所升高，而应用RvD1在LPS干预前30 min预处理小鼠，BALF中IL-6浓度显著下降，保护性细胞因子IL-10显著升高(与LPS模型组相比P<0.01)。提示RvD1可能抑制急性肺损伤小鼠促炎性细胞因子的分泌，促进抗炎性细胞因子的分泌，改善促炎反应与抗炎反应的平衡，从而对急性肺损伤发挥保护作用。

注：A: IL-6在BALF中的浓度；B: IL-10在BALF中的浓度；*P<0.01 vs. 对照组; #P<0.01 vs. LPS模型组

讨 论

在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中，RvD1预处理可显著减轻肺组织病理损伤，减少肺组织内浸润的炎症细胞，抑制炎性细胞因子IL-6的分泌，促进保护性细胞因子IL-10的分泌，通过减少MDA的产生，进而减轻氧化损伤，从多方面对急性肺损伤起保护作用。

当机体遭遇各种炎性刺激(如感染等)后，可促进炎症细胞在肺组织内大量浸润，促进各种氧自由基产生，促进TNF-α，IL-6，IL-1等促炎性细胞因子的大量释放，促进组织水肿，进而加剧组织损伤[8-9]。本研究中得出了相同的结论，在LPS干预组小鼠肺组织内浸润炎症细胞总数及中性粒细胞数显著增多，脂质氧化损伤指标MDA含量显著升高，上述改变提示LPS诱导小鼠急性肺损伤模型制作是成功的。

促炎细胞因子在急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征中起关键性作用。研究显示急性肺损伤和败血症临床患者，如IL-6和TNF-α等促炎性细胞因子持续性升高，则表示患者预后极差[10]。因此IL-6作为炎症的标志，其水平高低可显示炎症的轻重，本研究中IL-6明显升高，也提示急性肺损伤模型制作的成功。

在对急性肺损伤药物干预研究中显示，药物处理可显著抑制TNF-α，IL-6，IL-1等炎性细胞因子的分泌，减轻组织氧化损伤，进而减轻动物模型肺损伤，对肺组织起到保护作用[8-9, 11]。本研究中显示了相同的结论，而RvD1预处理后可显著减少肺组织内浸润的炎症细胞，抑制IL-6的大量分泌，减轻脂质氧化损伤，减轻小鼠肺组织病理损伤，对小鼠急性肺损伤发挥保护作用。

急性肺损伤的病理机制为抗炎反应与验证反应的失衡，而体内失控性释放的大量炎症介质与抗炎因子间的平衡决定了急性肺损伤病情的发展。IL-10作为人体内重要的抗炎因子，可抑制炎性反应，重建抗炎反应和炎症反应的平衡。研究发现，因ARDS死亡患者的疾病初期，如BALF中的IL-10浓度过低，则预后较差，提示IL-10不足可能是体内失控性炎症反应与抗炎反应失衡导致ARDS的预后较差[12-13]。进一步研究发现动物吸入IL-10可显著抑制BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，从而对急性肺损伤发挥保护作用[14-15]。因此IL-6/IL-10的比例在一定程度上反应了疾病的走向。在本研究中LPS模型组小鼠IL-6较对照组升高5.7倍，IL-10仅仅升高1.8倍，促炎反应与抗炎反应失衡。而应用RvD1预处理后IL-10的分泌较LPS模型组比较升高了16倍，RvD1可能具有重建炎症反应与抗炎反应的平衡，改善急性肺损伤的作用。

本研究证明了RvD1可促进抗炎性细胞因子IL-10的分泌，抑制促炎性细胞因子IL-6的产生，减少炎症细胞的浸润，改善肺组织病理变化，减轻组织氧化损伤，重建炎症反应与抗炎反应的再平衡，从多个方面抑制急性肺损伤的发生、发展。上述研究结果提示RvD1可能具有治疗急性肺损伤的潜在作用。

参 考 文 献

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