通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢指数和FSHR mRNA表达的影响*

★ 温莹莹 傅春华* 弓丽华 黄金珠 周昕

(成都中医药大学 四川 成都 610075)

不孕症是妇科临床的常见病，正成为全球生殖医学领域一个紧迫和日益引起关注的热点与难点问题。据统计不孕症在我国的发病率约为10%[1]，而排卵功能障碍型不孕约占女性不孕症的25%～30%[2]。以“补肾调冲”立法的通脉大生片是成都中医药大学附属医院的院内制剂，应用于临床50多年，其促排卵作用已被大量临床病例所证实，具有确切疗效[3]。本研究在前期实验基础上通过建立肾虚排卵障碍型不孕大鼠模型，用荧光定量RT-PCR方法检测大鼠卵巢FSHR mRNA表达量，阐明通脉大生片对卵泡发育和促排卵的干预环节，从分子生物学角度探讨其作用机制，进一步深化补肾调冲法促排卵的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级9日龄相同日期出生的雌性SD大鼠200只。四川简阳达硕生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXF(川)2008-24。

1.2 药物 通脉大生片(规格：每片含0.3g原生药)，批号：川药制字20130530，由成都中医药大学附属医院生产。来曲唑(规格：2.5mg)，批号：国药准字H19991001，由江苏恒瑞医药股份有限公司生产。右归丸(规格：1.8g/10粒)，批号：国药准字Z41022170，由河南宛西制药股份有限公司生产。丙酸睾酮注射液(规格：1mL：25mg)，批号：国药准字H12020531，由天津金耀氨基酸有限公司生产。

1.3 试剂 Eastep通用型总RNA 提取试剂盒(LS1000)，Promega；RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(K1621)，Fermentas；Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液(K0221)，Thermo Scientific；DEPC(Sigma)。

1.4 主要器材 高分辨率熔点曲线分析仪(BIO-RAD，CFX96)；电泳仪及电泳槽 (北京六一)；凝胶图像分析系统(BIO-RAD)；超低温冰箱(SANYO，MDF-U50V)；高速冷冻离心机(Sigma，1-15K)等。

2 方法

2.1 造模 参照余瑾等[4]方法复制排卵障碍型不孕大鼠模型。取9日龄SD雌鼠180只(实验组)，于颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25mg/只(0.05mL/只)。第22日龄断奶，同等条件饲养，由专人喂养。若大鼠表现为体重肥胖，易惊易怒，竖毛，毛质晦暗发黄，脱毛(以上表现与空白组进行对照)，提示肾虚证造模成功。待70日龄，大鼠阴道开口，连续阴道涂片2个性周期(1个性周期5天)。若阴道上皮无周期变化，呈持续性角化，提示排卵障碍大鼠模型造模成功。

2.2 分组 按随机数字表法将126只实验组大鼠分为疾病模型组(简称模型组)、通脉大生片高、中、低剂量组(简称通高、中、低组)、右归丸组、来曲唑组，每组各21只，加上正常组20只，共7组。

2.3 给药 从80日龄起，分别按如下方法称重灌胃，每天1次。以临床成人60kg体重为标准，按照体表面积-剂量换算法计算大鼠给药剂量。按1mL/(100g·d)体重灌胃，通高、中、低组分别按临床成人用药量的20倍、10倍、5倍灌胃；右归丸组按临床成人用药量的10倍灌胃；来曲唑组按临床成人用药量的10倍灌胃，连续灌胃2天后停药3天，并予阴道涂片。直至阴道涂片提示阴道脱落细胞出现有规律的周期性变化后停药。于灌胃5周时出现阴道脱落细胞周期性变化。

2.4 标本采集 第105日龄时处死各组大鼠，剖腹，取出卵巢组织，剥离干净后观察卵巢形态并称重，记录卵巢各项指标。于-80℃保存用于mRNA的定量分析。

2.5 卵巢组织FSHR mRNA表达量的测定

2.5.1 总RNA的提取 卵巢组织匀浆后，按照RNA 提取试剂盒(Promega)说明书抽提大鼠卵巢总mRNA。1%琼脂糖凝胶电泳(80V/cm，30min)鉴定总RNA质量。

2.5.2 逆转录反应 按照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行反转录反应。(1)反应体系(20μL体系)：2μL总RNA，1μL Oligo(dT)18引物，9μL Rnase-free Water，4μL 5×Reaction Buffer，1μL RNA酶抑制剂，2μL 10mM dNTP Mix，1μL M-MulV反转录酶。(2)反应条件：65℃孵育5min，42℃孵育60min。70℃加热5min终止反应。反转录产物-80℃保存。

2.5.3 荧光定量PCR反应 以β-actin基因为内参基因，对FSHR mRNA进行实时荧光定量PCR检测。

2.5.3.1 引物设计与合成 NCBI检索大鼠FSHR基因序列，用Primer Express 3.0软件设计引物，由上海生工生物工程有限责任公司合成。引物序列如表1。

表 1 引物信息

2.5.3.2 PCR 过程 将总RNA 反转录获得的cDNA 进行连续5倍浓度稀释，以各稀释度为模板进行实时荧光定量PCR，制作标准曲线和溶解曲线进行反应条件优化。(1)优化后的反应体系(10μL体系)：Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液5μL，上游引物(0.5μmol/L)0.5μL，下游引物(0.5μmol/L)0.5μL，cDNA(稀释60倍)3μL， Rnase-free Water 1μL。(2)FSHR和β-actin优化后的反应条件：95℃预变性10min；95℃ 10s，60℃ 60s，72℃ 15s，40个循环。每样本做4个复孔。

3 结果

3.1 对大鼠卵巢形态学的影响(肉眼观) 模型组卵巢苍白，表面见较少卵泡，且卵泡较小；各用药组和正常组卵泡数目明显多于模型组，卵泡明显增大；尤以来曲唑组最为明显，通高、中组和正常组次之。

3.2 对卵巢指数的影响 如表2。

表 2 各组大鼠卵巢指数的比较

由表1可知，与正常组卵巢指数比较，模型组明显降低，组间差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组卵巢指数比较，通高组升高，组间差异有显著统计学意义(P<0.01)，通中、低组和右归丸组也有所升高，组间差异无统计学意义(P>0.05)，来曲唑组升高明显，差异有显著统计学意义(P<0.01)；通脉大生片各剂量组比较，以通高组卵巢指数升高幅度最大，组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 FSHR mRNA表达量 见表3。与正常组比较，模型组卵巢降低且差异有统计学意义(P<0.05)；各用药组与模型组比较，通高组上调且差异有统计学意义(P<0.05)，通中组、来曲唑组均上调且差异有显著统计学意义(P<0.01)，通低组、右归丸组亦有所升高，差异无明显统计学意义(P>0.05)；通脉大生片各剂量组比较，通高组、通中组上调的幅度明显高于通低组，其中尤以通中组上调幅度最为显著。

表3 各组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量的比较

3.4 卵巢重量与卵巢FSHR mRNA表达量的相关性分析 如图1。

图1 卵巢重量与卵巢FSHR mRNA表达量的相关性

由图1可知，经Pearson相关分析，结果表明大鼠卵巢指数与卵巢FSHR mRNA表达量存在统计学弱正相关性(P<0.01，r=0.455)。

4 讨论

《素问·上古天真论》曰：“女子二七，天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子。”中医认为“肾藏精，主生殖”，肾与天癸、冲任、胞宫密切相关。肾精充盛，则卵子发育成熟，肾阳鼓动，则冲任气血调畅，从而促进成熟卵子的排出。故排卵障碍多责之于肾虚冲任失调。中医临床针对排卵障碍多从温肾益精，调补冲任论治。“补肾调冲法”作为中医治疗排卵障碍型不孕的治疗大法，在临床疗效中表现明显的优势。

通脉大生片是根据四川名老中医卓雨农自制方“通脉大生丸”研制的院内制剂，临床用于治疗妇科疾病60多年，尤其在治疗无排卵性功血和排卵障碍型不孕方面取得了肯定的疗效。方由17味中药组成，包括杜仲、续断、菟丝子、桑寄生、山药、肉苁蓉、当归、枸杞子等。诸药配伍共凑补肾养肝，调补冲任，和血通脉之效，因此该方是以补肾调冲为治疗大法的典型方剂之一。现代医学研究发现，鹿角胶、桑寄生具有抗氧化抗衰老的作用。菟丝子和续断中均含有黄酮类成分，具有促排卵的作用，其改善肾虚排卵障碍的物质基础可能基于其主要成分黄酮的作用[5]，为菟丝子温补肾阳的中医功效提供了科学依据。韦敏等报道[6]，枸杞中的多糖成分对自然衰老雌鼠卵巢有保护作用，其机制与影响性激素和IGF-β的分泌有关。当归有降低大鼠纤维蛋白原的作用[7]，可能通过影响卵巢局部血液流变学指数调节卵巢功能。这些单味药药物成分和功效的实验研究均为通脉大生片治疗排卵障碍型不孕提供了佐证。

FSHR属于G蛋白偶联型受体家族中的成员。FSH调节卵巢功能和卵泡发育功能的发挥必须通过卵巢颗粒细胞的FSHR所介导[8]。Abdennebi等人研究发现[9]，FSH的功能受FSHR表达数量或活性的调控。FSHR表达的增加可以改善卵巢对促性腺激素(Gn)的反应性，使卵泡数目和血清雌二醇峰值增加，可能会取得更好的排卵效果[10-12]。因此FSHR表达量对卵泡的发育有重要的促进作用。

现代医学研究报道卵巢排卵功能受下丘脑-垂体-卵巢生殖轴的调控，但越来越多的实验研究证实卵巢排卵还受自分泌-旁分泌因子的微调节[13,14]。有研究认为TGF-β超家族成员在卵泡发育的各个阶段有重要的作用[15]。更有研究证实TGF-β参与卵巢颗粒细胞FSH受体表达的上调[16,17]。

课题前期实验研究已经证实通脉大生片促卵泡发育和排卵的功效不仅调控下丘脑-垂体-卵巢生殖轴[18]有关，还与调控TGF-β/Smads信号转导通路有相关性，对肾虚排卵障碍型不孕具有肯定的治疗功效。研究结果显示TGF-β1与其受体在通脉大生片灌胃后的大鼠中表达量均上调[19,20]。用通脉大生片灌胃后大鼠卵巢超微结构发现模型组卵巢数目少，卵巢颗粒细胞稀疏，层次明显减少，大量闭锁卵泡和原始卵泡存在。而通脉大生片高、中、低剂量组卵巢卵泡颗粒细胞较模型组致密增厚，层次明显，有成熟卵泡形成。并且通脉大生片各剂量组血清FSH、LH数目也较模型组增多，表明通脉大生片可通过提高FSH、LH的分泌，调节卵泡的发育和卵巢排卵功能。

本实验选用丙酸睾酮复制肾虚排卵障碍型不孕模型。注射丙酸睾酮后的大鼠不仅出现阴道脱落细胞的病理改变，而且还表现出脱毛，惊恐易激惹行为。中医认为肾其华在发，在志为恐。肾精充，则毛发荣，情志和。肾精亏虚，则毛发枯槁，因虚致恐。中医理论在模型大鼠症状表现中得到印证，为中医科学化提供了研究思路。病、证结合是研制中医疾病、病理模型的最佳途径。丙酸睾酮制备的肾虚排卵障碍型不孕模型不仅排卵障碍的指标变化，还有“肾虚”体征。该模型是既与中医基础理论相吻合，又与中医临床实践相吻合的实用性动物模型，“病”、“证”结合，科学规范。

在前期实验基础上，本研究结果发现用通脉大生片灌胃后的卵巢FSHR的表达量明显上调，大鼠卵巢重量也明显较模型组增加，卵巢FSHR mRNA的表达量与卵巢指数之间存在一定的相关性，表明通脉大生片可提高卵巢组织FSHR mRNA的表达量，提高卵巢对FSH的反应敏感性，从而促进卵泡的发育和卵子的排出。因此，本实验得出结论，通脉大生片促进肾虚ASR大鼠的卵泡发育及排卵的机制可能与通过上调卵巢局部FSHR mRNA的表达，提高卵巢对FSH反应性有关，为补肾调冲法治疗肾虚排卵障碍型不孕提供了科学依据。至于FSHR mRNA表达的上调是否基于TGF-β1/Smads信号转导通路的调控而实现有待后期实验进一步研究。

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