HPLC法测定清肝利胆颗粒中栀子苷含量

★ 李建明 何杨虎 支永英 严健良

(江西天施康中药股份有限公司贵溪分公司 江西 鹰潭 335000)

清肝利胆颗粒是由口服液改剂型研制而成，由茵陈、厚朴、栀子、金银花、防己组成，能清利肝胆湿热，临床主治纳呆、胁痛、疲倦、乏力、尿黄、苔腻、脉弦、肝郁气滞、肝胆湿热未清等症[1]。现行质量标准中采取HPLC法测定厚朴酚含量，但由于其工艺为水煎煮，厚朴酚与和厚朴酚得率非常低(低于万分之一)，测定其含量意义不大，故本文采取测定栀子中栀子苷的含量来进行质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪Agilent1100系列 ：G1311A四元泵，G1315B DAD检测器，全自动进样器，Agilent化学色谱工作站；TU-1901双光束紫外可见分光光度计；Sartorius BP211D十万分之一电子天平。色谱柱：Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；资生堂C18柱 (100mm ×4.6 mm,3μm)；Agela venusil MP C18柱 (250mm×4.6mm,5μm)。

1.2 试剂 乙腈为色谱纯，水为三重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.3 试药 清肝利胆颗粒(江西天施康中药股份有限公司余江分公司，批号：120206、120306、120307)；栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号为110749-200511，供含量测定用)。

2 方法与结果

2.1 检测波长的确定 栀子苷对照品适量，分别置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。通过紫外可见分光光度计对对照品溶液进行200～400nm扫描，结果栀子苷在239nm波长处有最大吸收,参考文献，最终确定为238nm[2]。

2.2 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-水 (10∶90)为流动相，流速为1mL/min，检测波长为238nm，柱温为室温。理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000。在此条件下对照品、供试品在25.7min左右出峰。

2.3 线性范围 精密称取栀子苷对照品18.16mg，置100mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀,再精密量取3mL，置10mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得栀子苷对照品溶液。精密吸取栀子苷对照品溶液1, 5, 10, 15 ,20, 30μL，注入液相色谱仪，按正文色谱条件测定峰面积，分别以栀子苷峰面积积分值为纵坐标，各自对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，栀子苷回归方程为Y=1477.552959X-1.768984，r=0.99999。栀子苷在0.05448～1.6344μg之间呈良好线性。

2.4 阴性对照试验 按处方取不含栀子的其他药材，制备成栀子阴性对照溶液，另取倾肝沥胆颗粒样品(批号：120206)0.5g，精密称定，依法制备供试品溶液。分别取10μL进样，结果供试品中栀子苷色谱峰有较好的色谱分离，见图1。

A.栀子苷对照品；B.供试品；C.栀子阴性对照

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，按上述色谱条件，重复进样6次，测定栀子苷对照品溶液和供试品溶液中栀子苷峰面积，结果峰面积RSD分别为0.1%，0.3%。

2.6 重复性试验 取本品内容物(批号：120206)适量，按样品测定项下方法，平行制备六份供试品溶液,按上述色谱条件，进样测定栀子苷峰面积，结果峰面积RSD为1.2%。

2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液,按上述色谱条件，每隔一定时间进样一次测定供试品溶液中栀子苷峰面积,结果供试品溶液中栀子苷在24 h内峰面积无明显变化，其峰面积RSD分别为1.1%。

2.8 加样回收率试验 取本品内容物(批号：120206)0.60g,0.25g和0.20g，分别精密称定，置具塞锥形瓶中，各精密加入栀子苷对照品4.874mg，1.816mg和1.652mg，按样品测定项下方法，制备成高、中、低三个浓度的供试品加样回收率试验样品，按上述色谱条件进样，计算回收率，结果高、中、低三个浓度的供试品加样平均回收率分别为98.32%，99.77%和99.01%，RSD值分别为1.85%，1.30%和1.61%。

2.9 样品测定 取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率25kHz)30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述色谱条件，测定栀子苷的含量。结果见表1。

表1 3批清肝利胆颗粒含量测定结果(n=3)

3 讨论

清肝利胆颗粒中厚朴有效成分厚朴酚与和厚朴酚难溶于水，采用水煎煮提取，成品中转移率很低，而栀子中有效成分栀子苷易溶于水，提取率较高，成品含量也较高，因此采用HPLC法测定本品中栀子苷的含量，更有利于产品的质量控制。

本试验研究了供试品溶液制备方法，通过考察提取溶媒的种类(甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇)，提取方法(回流提取和超声提取)，超声提取溶媒用量，以及超声提取时间(10～50min)，从而确定最佳供试品溶液的制备方法。

本试验考察了Diamonsil C18，资生堂C18柱，Agela venusil MP C18柱三种色谱柱对本方法的检测耐用性，结果表明栀子苷峰在各种色谱柱均分离良好，测得含量无显著差异，说明方法重视性良好。

[1]国家食品药品监督管理局药品质量标准：WS3-182(Z-182)-2002(Z)(清肝沥胆颗粒).

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010：1 116.