高效毛细管电泳内标法测定山银花中绿原酸含量*

★ 徐东升 高言明 杨春 林昌虎 吴明花 唐才林

(1.贵阳中医学院 贵州 贵阳 550002；2. 贵州理工学院 贵州 贵阳 550003；3.贵州科学院 贵州 贵阳 550001)

高效毛细管电泳在分析药物成分时具有诸多优点，但由于采用压力进样，样品的小瓶盖气密性不好而导致进样体积精密度差，最终含量测定结果不准确，若采用内标法可消除这一缺陷。而内标物的确定往往比较困难，经过多次试验，最终选择了腺苷作为本实验的内标物，并成功地对山银花样品中绿原酸进行了准确测定，为高效毛细管电泳的推广使用和山银花的质量研究提供了实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效毛细管电泳仪(美国安捷伦公司)，DAD检测器，安捷伦化学工作站，自动进样器； AE-240双量程电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；Dela320型pH计(梅特勒-托利多上海有限公司)；超声清洗器(KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司)；熔融石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件有限公司)。

1.2 试药 绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：110753-200413)；腺苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110879-200202)；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。药材样品分别于2012年4月底至5月初采自贵州省绥阳县小关乡的15个灰毡毛忍冬种植点和安龙县德卧镇、兴义市则戎乡的黄褐毛忍冬种植点，经贵阳中医学院副教授魏升华鉴定为灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand-Mazz和黄褐毛忍冬LonicerafulvutumentosaHsu et S.C.Cheng的花蕾。样品在室内阴干经粉碎后于45℃烘至恒重并置于干燥器中备用。

A.腺苷；B.绿原酸

A.腺苷；B.绿原酸

2 方法与结果

2.1 电泳条件[1]毛细管：75μm×96cm的熔融石英毛细管柱，有效长度为87.8cm；DAD检测器，检测波长为254nm；以20mmol/L的硼砂(pH=9.12)作为缓冲溶液；工作电压30KV，压力进样：20KPa,15S；缓冲溶液封口：10KPa，5S；柱温20℃；每次进样前用缓冲溶液冲柱15min。分离结果见图1和图2。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成浓度为0.10mg/mL的绿原酸对照品溶液。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取腺苷适量，加甲醇制成浓度为0.10mg/mL的腺苷内标溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备[2]精密称取山银花样品粉末约0.1g，置于具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液40mL，超声45min，取出，放冷，过滤，精密吸取滤液1mL于10mL量瓶中，再精密加入腺苷内标溶液1mL，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜虑过，即得供试品溶液。

2.3 线性关系的考察 分别精密吸取浓度为0.10mg/mL的绿原酸对照品溶液0.3，0.8，1.3，1.8，2.3，2.8mL，置于6个10mL的容量瓶中，各精密加入“2.2.2”项下制备好的内标溶液1mL，用甲醇定容至刻度，摇匀，得一浓度梯度的混合对照品溶液，分别吸取上述浓度的混合对照品溶液0.45mL置于6个样品小瓶中，用新的样品小瓶盖盖紧，按“2.1”项下的“电泳条件”进行电泳分离测定。以绿原酸和腺苷的峰面积之比为纵坐标(Y)，以绿原酸浓度为横坐标(X)进行回归计算，得绿原酸的回归方程为：Y=0.0771X-0.0299，r=0.9990。结果表明当腺苷的浓度为0.01mg/mL时，绿原酸在3～28mg/mL范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 在样品小瓶中精密加入内含0.01mg/mL的腺苷内标物，浓度为13μg/mL的绿原酸对照品溶液0.45 mL，用新的样品小瓶盖盖紧，按“2.1项下电泳条件”重复测定6次，以测得绿原酸和腺苷的峰面积比值计算RSD为0.59%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取按“2.2.3”项下制备的供试品溶液，在0, 2, 4, 6, 8, 10, 12h分别按“2.1项下的电泳条件”进行电泳分离测定，以绿原酸和腺苷的峰面积比值计算RSD为1.01%，表明样品在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 精密称取山银花样品粉末约0.1g，共6份，分别置于6个具塞锥形瓶中，按“2.2.3”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，按“2.1”项下的“电泳条件”进行电泳分离测定，得样品中绿原酸平均含量为3.23%，RSD为1.57%。

2.7 加样回收试验 精密称取已知绿原酸平均含量为3.23%的山银花样品粉末6份，每份约0.05g，分别置于具塞锥形瓶中，在每份样品中加入用50%甲醇溶液配制的浓度为0.04mg/mL的绿原酸对照品40mL，按“2.2.3”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，按“2.1”项下的“电泳条件”进行电泳分离测定，计算出绿原酸的平均回收率为98.61%，RSD为2.78%，表明本法能够准确地测定中药山银花中绿原酸的含量。

2.8 含量测定 分别精密称取各药材样品粉末约0.1g，按“2.2.3”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，按“2.1”项下的“电泳条件”进行电泳分离测定，结果见表1。

表1 黔产山银花中绿原酸含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 虽然高效液相色谱法测定山银花中绿原酸含量的方法已经较为成熟[3,4],而只要内标物选定准确，采用高效毛细管电泳法更具有准确，省时，简便和环保等的优势。

3.2 绿原酸的最大吸收波长为330nm，但在此波长下内标物腺苷却没有吸收。选择254nm处绿原酸和腺苷均有较大响应信号，且杂峰较少，测定结果较为理想，故本实验采用254nm作为检测波长。

3.3 由测定结果可以看出，灰毡毛忍冬中的绿原酸均较黄褐毛忍冬高，如果仅用绿原酸含量高低来评价山银花质量，那么灰毡毛忍冬的质量应该优于黄褐毛忍冬[5]。

[1]高言明，宋勤，陈惠玲，等.毛细管区带电泳法测定人工种植粗毛淫羊藿中绿原酸的含量[J].药物分析杂志, 2006,26(8)：1 088-1 090.

[2]张露，陈豆弟. 绿原酸提取工艺研究进展[J].杭州化工，2012,43(4)：4-6.

[3]李锦粲 吴洪文.HPLC同时测定山银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J].北方药学， 2013，10(8)：10-11.

[4]中国药典委员会. 中国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社, 2010：28.

[5]刘岚, 李荣. 山银花药用成分的提取及抑菌活性研究[J].中南医学科学杂志, 2012，40(3)：298-299.