MMP-9和咬合蛋白在弥漫性脑损伤大鼠皮层的表达变化及与脑水肿的关系

赵轶群 王丽娜 刘永亮 王鹏

·论著·

MMP-9和咬合蛋白在弥漫性脑损伤大鼠皮层的表达变化及与脑水肿的关系

赵轶群 王丽娜 刘永亮 王鹏

目的观察弥漫性脑损伤大鼠脑水肿及损伤区皮层MMP-9和咬合蛋白表达的变化。方法成年健康SD雄性大鼠160只,按随机数字表法分为对照组(n=60)和模型组(n=100)。应用Marmarou’s法建立弥漫性脑损伤大鼠模型。2组分别于术后3、12、24、72、144 h行干湿重法检测2组大鼠脑组织含水量变化，行免疫组化和Western blot检测损伤区周围皮层MMP-9和咬合蛋白表达水平。对各结果进行相关性分析。结果与对照组比较，模型组各时间点大鼠脑组织含水量明显增加，脑组织损伤区周围皮层MMP-9表达明显增高(P<0.05)，咬合蛋白表达明显降低(P<0.05)。脑组织含水量变化与MMP-9表达变化呈正相关(P<0.05)，脑组织含水量变化与咬合蛋白表达变化呈负相关(P<0.05)，MMP-9蛋白表达变化与咬合蛋白表达变化呈负相关(P<0.05)。结论弥漫性脑损伤发生后损伤区皮层MMP-9蛋白表达明显增加，咬合蛋白表达明显降低，脑水肿形成。MMP-9表达的增加，导致了咬合蛋白破坏，脑水肿形成。

弥漫性脑损伤；脑水肿；基质金属蛋白酶-9；咬合蛋白

脑水肿是颅脑创伤发生后主要的病理生理过程之一，可引起颅内压增高，明显加重颅脑创伤的病理损害。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一种Zn2+依赖性蛋白酶，可攻击脑血管外基膜的层黏蛋白和纤粘蛋白，破坏血脑屏障，与脑水肿形成密切相关。咬合蛋白是脑微血管紧密连接的主要组成部分之一。有关弥漫性脑创伤大鼠脑水肿和皮层MMP-9、咬合蛋白表达之间的关系尚未见临床报道。本研究采用Marmarou’s[1]法制造弥漫性脑创伤大鼠模型，观察MMP-9和咬合蛋白表达变化与脑水肿形成之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组 成年SD雄性大鼠160只，清洁级,平均体重(300±20)g，购自北京维通利华公司(合格证：SCXK(京)2002-003)，于河北联合大学动物实验中心，在常温下常规饲料喂养。所有动物实验遵循国际生命指导中心关心和使用动物实验原则。按随机数字表法分为对照组(n=60)和模型组(n=100)。

1.2 模型制备 参考Marmamu法[1]制作大鼠弥漫性脑创伤模型：乙醚麻醉动物(麻醉时间约为70～150 s)，将麻醉好的大鼠俯卧位固定于海面床垫(10 cm×20 cm×30 cm)上，将质量450 g、直径18 mm的铜棒自1.5 m高度垂直落下撞击置于大鼠冠状缝与失状缝正中的不锈钢垫，造成大鼠弥漫性颅脑创伤模型。正常对照组动物只进行乙醚麻醉而不致伤。在模型制作过程中死亡32只，给予补充。

1.3 脑组织含水量测定 随机选取2组各时间点大鼠各5只，以10%水合氯醛麻醉，断头处死，开颅取脑，从损伤区周围取200 mg左右的脑组织，采用MA110电子分析天平(上海第二天平仪器厂)称湿重并记录后置于105℃恒温干燥箱内干燥48 h至恒重，称干重后按Elliot公式计算脑含水量：脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4 免疫组化检测脑损伤周围皮层MMP-9和咬合蛋白表达变化 随机选取2组各时间点大鼠各5只，10%水合氯醛深度麻醉后开胸,4%多聚甲醛灌注,断头取脑,置于4%多聚甲醛液中4℃冰箱过夜至组织块沉底。冠状切取2 mm厚包含损伤区域及左右半球的组织块浸于4%多聚甲醛中再固定4 h。经自来水冲洗48 h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将石蜡包埋的组织块取出放入切片机中做连续切片,片厚5 μm。

取各大鼠等部位切片3张，经二甲苯二级脱蜡各5 min，梯度乙醇脱水，3%H2O2溶液室温10 min，以消除内源性过氧化物酶，高压热修复，后滴加1∶100比例稀释的咬合蛋白一抗(武汉博士德生物工程有限公司)4℃过夜，次晨取出置常温，PBS缓冲液冲洗后，滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB显色，水冲洗后苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。光镜下观察细胞核呈蓝色，阳性细胞肿胀，包浆黄染。在400×显微镜下在伤灶周围随机选取5个视野，用美国Media Cybernetics公司生产的Image-Pro-Plus图像分析系统照相后计算每个视野中阳性细胞数目。

1.5 Western blot 检测脑损伤周围皮层MMP-9和咬合蛋白表达变化 用细胞裂解液提取各组各时间点大鼠损伤区周围脑组织总蛋白，运用考马斯亮蓝比色法测定各个样本蛋白含量，上样量为100 μg蛋白。进行15%SDS-PAGE凝胶电泳，NC转膜，5%脱脂奶粉封闭；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶1 000稀释)、山羊抗咬合蛋白(rI’11r18/serl9)多克隆一抗(1∶1 000稀释) 、山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀释)，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀释)进行杂交。EcL发光剂3 min，曝光、显影、定影。采用数码成像分析系统软件分析Westem blot结果平均灰度值，以目标的平均灰度值比内参的平均灰度值比值的大小作为分析对象进行比较。

1.6 相关性分析 采用线性相关分析法分别对脑组织含水量变化与MMP-9免疫组化结果、脑组织含水量与咬合蛋白免疫组化结果、脑组织含水量与MMP-9 Western blot结果、脑组织含水量与咬合蛋白Western blot结果进行相关性分析。

2 结果

2.1 脑组织含水量测定 对照组各时间点脑组织含水量无明显差异。与对照组比较，模型组大鼠脑组织含水量明显增高(P<0.05)。其中3 h脑组织含水量开始增加，12 h继续增加，24 h达到高峰，72 h脑组织含水量开始降低，144 h脑组织含水量明显降低。见表1。

组别3h12h24h72h144h对照组71．67±0．2771．76±0．2271．70±0．2671．81±0．0971．73±0．28模型组74．16±0．2375．54±0．2479．30±0．2778．05±0．2573．10±0．17F值246．23660．972068．872744．3785．86P值0．000．000．000．000．00

2.2 MMP-9免疫组合结果 对照组可见一定量被染成棕黄色的阳性细胞，胞膜表达，各时间点阳性细胞数无明显差异(P>0.05)。与对照组比较，模型组大鼠损伤区周围阳性细胞数明显增多(P<0.05)。其中伤后3 h MMP-9阳性细胞数即开始增多，24 h达到高峰，72 h开始减少，144 h明显减少。见表2。

组别3h12h24h72h144h对照组19．4±2．319．6±2．720．2±4．021．0±2．820．0±2．4模型组28．6±2．755．4±3．2111．8±3．075．8±2．927．4±3．2F值33．59364．101719．38926．8617．33P值0．000．000．000．000．00

2.3 咬合蛋白免疫组化结果 对照组可见一定量被染成棕黄色的阳性细胞，细胞核表达，各时间点阳性细胞数无明显差异。与对照组比较，模型组大鼠损伤区周围阳性细胞数明显减少(P<0.05)。其中伤后3 h咬合蛋白阳性细胞数开始减少，24 h减少最明显，72 h开始增加，144 h明显增加。见表3。

组别6h12h24h72h144h对照组38．4±1．538．2±1．938．6±1．738．8±0．438．2±0．8模型组29．8±0．417．2±2．610．0±2．615．6±1．130．8±3．0F值147．92212．02417．33326．2129．13P值0．000．000．000．000．00

2.4 MMP-9 western blot结果 对照组各时间点蛋白含量无明显差异。与对照组比较，模型组大鼠损伤区脑组织咬合蛋白含量明显增加(P<0.05)。其中伤后3 h咬合蛋白含量开始减少，24 h减少最明显，72 h开始增加，144 h明显增加。见表4，图1。

组别3h12h24h72h144h对照组0．175±0．0090．172±0．0090．173±0．0090．175±0．0090．177±0．007模型组0．290±0．0110．480±0．0090．775±0．0060．654±0．0050．346±0．005F值323．083088．2414986．6511733．221894．14P值0．000．000．000．000．00

2.5 咬合蛋白 Western blot 结果 对照组各时间点蛋白含量无明显差异。与对照组比较，模型组大鼠损伤区脑组织咬合蛋白含量明显增加(P<0.05)。其中伤后3 h咬合蛋白含量开始减少，24 h减少最明显，72 h开始增加，144 h明显增加。见表5，图1。

组别6h12h24h72h144h对照组2．2544±0．00772．2560±0．00842．2550±0．00702．2551±0．00812．2555±0．0092模型组1．8687±0．00711．7034±0．00691．4626±0．00811．6450±0．00611．9703±0．0061F值6790．9812760．7627501．8018175．213320．80P值0．000．000．000．000．00

1A：MMP-9在对照组各时相点的表达，其在各时相点的表达无明显差异；1B：MMP-9在模型组各时相点的表达，其在造模成功后3 h(第1个条带)开始增加，24 h(第3个条带)达高峰，72 h开始减少(第4个条带)，144 h(第5个条带)明显减少；1C：occludin在对照组各时相点的表达，其在各时相点的表达无明显差异；1D：occludin在模型组各时相点的表达，其在造模成功后3 h(第1个条带)开始减少，24 h(第3个条带)减少最明显，72 h开始恢复(第4个条带)，144 h(第5个条带)明显恢复；1E：内参，内参在各组各时间点的表达无变化。

图4 损伤周围脑组织咬合蛋白表达

2.6 相关性分析结果 (1)伤后各时间点脑组织含水量变化与MMP-9免疫组化结果呈正相关(r=0.962，P<0.05)。(2)伤后各时间点脑组织含水量变化与咬合蛋白免疫组化结果呈负相关(r=-0.904，P<0.05)。(3)伤后各时间点脑组织含水量变化与MMP-9 Western blot结果呈正相关(r=0.904，P<0.05)。(4)伤后各时间点脑组织含水量变化与咬合蛋白Western blot结果呈负相关(r=-0.966，P<0.05)。(5)伤后各时间点MMP-9免疫组化结果与咬合蛋白免疫组化结果呈负相关(r=-0.915，P<0.05)。(6)伤后各时间点MMP-9 Western blot结果与咬合蛋白Western blot结果呈负相关(r=-0.940，P<0.05)。

3 讨论

脑水肿是颅脑创伤发生后的主要继发性病理过程。本研究应用干湿重法检测弥漫性脑创伤大鼠脑组织含水量的变化提示伤后3 h脑水肿即开始形成，24 h达到高峰，72 h开始缓解，144 h脑水肿明显缓解，与以往学者研究结果大致相符。有关脑创伤后脑水肿的形成机制包括脑出血、微循环障碍、炎症反应、自由基损伤、钙超载、血脑屏障破坏等[2]。而有关MMP-9和咬合蛋白对脑创伤后脑水肿的影响尚未见临床报道。

基质金属蛋白酶是一组调节细胞外基质成分的Zn2+依赖性重要蛋白酶。MMP-9是基质金属蛋白酶的一类，主要存在于脑组织的海马、皮质和纹状体中，但正常情况下含量很少[3]。正常情况下，MMP-9以酶原的形式存在，MMP-9酶原被激活后迅速被降解，以防其过度活化[4]。本研究采用免疫组化和Western blot检测脑创伤大鼠皮层MMP-9蛋白表达的变化提示伤后3 h损伤区皮层MMP-9表达即开始增加，24 h达高峰，72 h开始降低，144 h MMP-9表达量明显降低。相关性分析提示伤后脑水肿变化与MMP-9表达变化呈正相关，提示MMP-9参与了脑水肿的形成。Gidday等[5]发现白细胞，特别是中性粒细胞是脑梗死后MMP-9的来源。而MMPs的基因表达受以下三方面的调控：(1)MMPs基因表达受细胞因子(IL-1、IL-6等)、生长因子(VEGF、FGF)、蛋白激酶、糖皮质激素等调控；(2)MMP-9酶原需要被MMP-3、纤溶酶及纤溶酶原激活物、NO等激活为有活性的MMP-9[6]；(3)血浆中的α2巨球蛋白能抑制MMP-9的活性。所以我们认为当脑创伤发生时可继发炎症反应，导致中性粒细胞数目增高，MMP-9产生增多。此外颅脑创伤后炎性因子TNF、IL-1、IL-6等表达增加，进而激活MMP-9，发挥其生物学活性，导致脑水肿的形成。

咬合蛋白是脑微血管紧密连接的主要成分，与脑水肿形成的关系密切。本研究应用免疫组化和Western blot对大鼠脑创伤后皮层咬合蛋白的表达进行研究发现：弥漫性脑损伤后3 h咬合蛋白表达开始减少，24 h减少最明显，72 h后开始增加，144 h后损伤区咬合蛋白含量明显增加。相关性分析结果提示脑水肿与皮层咬合蛋白表达变化呈负相关,且为显著相关。提示咬合蛋白的破坏与脑水肿的形成密切相关。Yu等[7]研究表明，当咬合蛋白表达下降时，紧密连接功能受损，对离子的通透性增加，证明咬合蛋白对维持紧密连接的正常功能有非常重要的作用。MMP-9与咬合蛋白表达变化相关性分析提示两者呈负相关，显著相关。而且MMP-9和咬合蛋白均与脑水肿的形成密切相关，我们认为脑创伤发生后通过炎症反应等激活MMP-9，而MMP-9降解了咬合蛋白，导致紧密连接破坏，血脑屏障通透性增高，脑水肿加重。

1 Marmarou A，Foda MA，van den Brink W，et al．A new model of diffuse brain injury in rats.Part I：Pathophysiology and biomechanics.Neurosurg,1994,80：291-300．

2 刘永亮，王鹏，李建民.脑损伤后脑水肿的发病机制研究进展.中国医药指南，2013,11：76-78.

3 Wagner S,Nagel S,Kluge B,et al.Topographically graded postischemic presence of metalloproteinases is inhibited by hypothermia.Brain Res,2003,984:63-75.

4 Yu Q,Stamenkovic I.Localization of metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44-mediated tumor invasion.Genes Dev,1999,13:35-48.

5 Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al．Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289：558-568.

6 Dzwonek J,Rylski M,Kaczmarek L.Matrix Metedloproteinases and their endogenous inhibitors in neuronal physiology of the adult brain.FEBS Lett,2004,67:129.

7 Yu AS,Mc Carthy KM,Francis SA,et al.Knockdown of occluding expression leads to diverse phenotypic alterations in epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol,2005,288:C1231-C1241.

ThechangesofexpressionofMMP-9andoccludininbraincortexofratswithdiffusebraininjuryandthecorrelationbetweenthechangesandbrainedema

ZHAOYiqun*,WANGLina,LIUYongliang,etal.*TheTenthHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the changes of expression of MMP-9 and occludin in brain cortex of rats with diffuse brain injury and the changes of brain edema around injury region.MethodsThe 160 Sprague-Dawley adult male rats were randomly divided into control group (n=60) and model group (n=100).The animal models with diffuse brain injury were established in rats by means of Marmarou’s method.At 3h,12h,24h,72h and 144h after injury,brain water content was detected by dry wet weight measurement method in both groups,and the expression levels of MMP-9 and occludin around the injury area were measured by immunohistochemistry and Western Blot.Finally the correlation analysis was performed about these results.ResultsAs compared with that in control group,the brain water content in model group was significantly increased in different time points,and the expression levels of MMP-9 around injury area were obviously increased (P<0.05),however,the content of occludin was significantly decreased.The changes of brain water content were positively correlated to those of MMP-9 (P<0.05).However the changes of brain water content were negatively correlated to those of occludin expression levels (P<0.05),so were between MMP-9 expression and occludin expression.ConclusionAfter the diffuse traumatic brain injury,the expression levels of MMP-9 in brain cortex around injury area are obviously increased,however,the expression levels of occluding are significantly decreased,and brain edema appears.The increase of MMP-9 expression levels results in the decrease of occludin expression levels,as a result,brain edema occurs.

diffuse brain injury;brain edema;MMP-9;occludin

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.004

063000 河北省唐山市第十医院(赵轶群)；河北省唐山市人民医院(王丽娜)；河北联合大学(刘永亮、王鹏)

R 651.1

A

1002-7386(2014)04-0495-04

2013-09-07)