复方多西环素缓释凝胶对实验性牙周炎龈沟液IL-4和TNF-α的影响

程凤峡 田华 吴永生 王志洁 郑瑶

·论著·

复方多西环素缓释凝胶对实验性牙周炎龈沟液IL-4和TNF-α的影响

程凤峡 田华 吴永生 王志洁 郑瑶

目的研究复方多西环素缓释凝胶对实验性牙周炎大鼠牙龈指数(GI)、牙周袋深度(PD)、附着丧失程度(AL)及龈沟液中白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响。方法选用Wister大鼠42只，随机分为3组：正常对照组(N组)，阳性对照组(C组)和实验组(T组)，每组14只。C组和T组建立牙周炎模型后，C组给米诺环素软膏治疗，T组给复方多西环素缓释凝胶治疗，均为每周上药1次共4次，并分别在治疗前和治疗后记录GI、PD、AL及龈沟液中IL-4和TNF-α水平。结果治疗后，C组和T组GI、PD、AL均较治疗前显著下降(P<0.05)。牙周炎大鼠龈沟液中IL-4水平显著低于正常组(P<0.05)，治疗后显著增高(P<0.05)，且T组明显高于C组(P<0.05)；牙周炎大鼠龈沟液中TNF-α水平显著高于正常组(P<0.05)，治疗后显著降低(P<0.05)，T组和C组治疗后差异无统计学意义(P>0.05)。结论复方多西环素缓释凝胶能明显改善牙周炎临床症状，显著降低龈沟液中TNF-α水平，提高龈沟液中IL-4水平。

缓释凝胶；多西环素；骨碎补；龈沟液；白介素-4；肿瘤坏死因子-α

牙周炎是菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因。牙周致病菌及其毒性产物引发的宿主免疫和炎性反应是造成牙周组织破坏的主要原因[1]。对于调节宿主防御功能的治疗方法研究者们有许多尝试，但多集中于西药或中药的全身应用，这在很大程度上限制了研究结果的临床应用。复方多西环素缓释凝胶是我院自己研制的牙周炎局部缓释制剂，主要有效成分是盐酸多西环素和骨碎补。本实验将其应用于大鼠的实验性牙周炎，比较治疗前后临床症状和龈沟液内一些局部组织免疫产物的浓度，评估其对于宿主牙周炎牙周组织的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备 梅特勒AG-254电子分析天平，ALISEI全自动酶标仪，SANYO MDF-382低温冰箱，Hettich RS-28型低温离心机，多西环素(华北制药集团)，1-甲基-2-吡咯烷酮(1MP)、三乙酸甘油酯(GAT) 由北京奇松生物科技有限公司提供，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由长春圣博玛生物材料有限公司提供，派力奥软膏(日本新时代制药株式会社)。

1.2 复方多西环素缓释凝胶制备 骨碎补煎煮、过滤，浓缩、醇沉，配制成质量浓度为每毫升含1 g生药的骨碎补提取液。精密称取骨碎补提取液20 mg，用约100 mg混合溶剂(1MP∶GAT=7∶3)溶解，再取PLGA75∶25计600 mg，用混合溶剂1 g溶解，待完全溶解后，倒入含有骨碎补的试管中，加入多西环素原料200 mg，最后加入混合溶剂至2 g，漩涡震荡，分装，4℃避光保存。

1.3 实验动物与分组 选用纯种Wister大鼠，雌雄各21只，体重(250±10)g。随机分为3组，每组14只。正常对照组(N组)：不做任何处理；阳性对照组(C组)：米诺环素软膏(派力奥)治疗组；实验组(T组)：复方多西环素缓释凝胶治疗组。

1.4 实验方法 实验动物适应性喂养1周后，腹腔注射2%戊巴比妥钠20 mg/kg麻醉，C组和T组大鼠用直径为0.2 mm的正畸钢丝结扎双侧上颌第一磨牙，结扎丝尽量放入龈沟内。自结扎日起动物给予高糖喂养，8周后每组随机取1只大鼠，麻醉下观察第一磨牙牙周组织变化，探诊牙周袋，处死动物后制作右上颌第一磨牙牙体牙周联合切片。成模标准为组织学观察：结合上皮向根方增殖，固有层结缔组织炎性细胞浸润，牙周膜纤维排列紊乱，牙槽骨吸收，可见骨陷窝。牙周炎模型鉴定成功后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠20 mg/kg麻醉，C组牙周袋内注入盐酸米诺环素软膏(派丽奥软膏，新时代株式会社)，T组给牙周袋内注射复方多西环素缓释凝胶，均至龈缘有药物溢出；每周1次，重复4次。在第1次上药前(治疗前)和最后1次上药后1周(治疗后)，记录3组指标。所有临床指标数据均由同一位不了解分组情况的牙周医生测定。

1.5 龈沟液IL-4和TNF-α含量测定 大鼠麻醉后双侧上颌第一磨牙牙面擦干隔湿，用3个已称量的whatman滤纸条(2 mm×10 mm)插入取样牙的颊侧近中、中央及远中3个位点的牙周袋内，直至遇轻微阻力为止，30 s后取出合并放入一个Ep管中(若有血液和唾液污染，则弃置不用)。用电子分析天平分别称量龈沟液提取前滤纸条和Ep管的重量及其提取龈沟液后的重量，两者相减即得龈沟液的重量，按1 mg/ml换算成体积。Ep管中加入PBS缓冲液200 μl，-70℃保存。检验时室温解冻，4℃离心10 min(1 000 r/min)，取上清液备用。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，按试剂盒说明书(试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司)提供的操作方法，测定龈沟液内IL-4和TNF-α含量。

1.6 牙周临床指标的测定

1.6.1 牙龈指数(GI)[1]：将牙周探针沿龈缘轻轻滑动，观察有无出血。0=正常牙龈；1=轻度炎症: 轻度颜色改变，轻度水肿；2=中度炎症：色红，水肿，探诊出血；3=重度炎症：明显发红，水肿，红肿明显或有溃疡，有自发出血倾向。

1.6.2 牙周袋深度(PD)：用牙周探针(Nordent SST,USA)测量近中颊、颊侧、远中颊3个点牙周袋深度，取均值。

1.6.3 附着丧失程度(AL)：测量牙周袋深度后，当探针尖沿牙根面退出时，探寻釉牙骨质界位置，测得釉牙骨质界到龈缘的距离，将袋深度减去该距离即为附着丧失的程度。

1.7 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

治疗前C组和T组的各项数据差异均无统计学意义(P>0.05)，与N组差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，C组和T组GI、PD、AL和TNF-α均较治疗前显著下降(P<0.05)，IL-4有显著上升(P<0.05)。治疗后T组和C组比较，GI和TNF-α差异无统计学意义(P>0.05)，而PD、AL和IL-4的差异有统计学意义(P<0.05)，T组的改善更为明显(P<0.05)。见表1、2。

表1 3组治疗前后牙龈指数、牙周袋深度和附着丧失变化

表2 3组龈沟液中IL-4和TNF-α水平

注：与N组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05；与治疗前比较，△P<0.05

3 讨论

牙周袋内缓释药物逐渐成为牙周病药物治疗的发展趋势。牙周局部缓释用药的理想标准包括：(1)对牙周致病菌有较强的杀灭或抑制作用；(2)药物可持续释放较长时间发挥作用，减少不良反应；(3)可促进牙周组织再生；(4)减少上药频率，提高患者依从性；(5)药物可贴附在牙周袋中不易脱落，无不适；(6)缓释载体有良好的生物相容性，无刺激，可生物降解；(7)剂型便于临床操作，能深入牙周袋底及根分叉处等；但目前临床尚没有一种制剂能满足这些要求[2，3]。

本研究缓释凝胶中治疗药物多西环素和骨碎补提取液在牙周治疗中具有抑菌、抗胶原酶、促进成纤维细胞的成骨分化及在牙面附着等多重作用；PLGA作为缓释辅料使药物进入牙周袋变成膜状，不但能明显延长药物释放时间，还可以阻挡牙龈上皮向牙周袋内生长，且具有良好的生物相容性，可降解，已被FDA正式批准为药用辅料[4]；1-甲基-2-吡咯烷酮作为溶剂，三乙酸甘油酯作为增塑剂，均有良好的生物降解性能，对凝胶最终的物理性状起到重要作用，满足了牙周局部凝胶应用方便，可深入牙周袋底部及根分叉区，药物缓慢释放，不易脱落，异物感小等要求。

牙周炎的发病过程与Th1/Th2免疫应答平衡的失调有密切关系，Th1型细胞因子可加重牙周组织的炎症和增加牙槽骨的破坏程度，Th2型细胞因子可有效减轻牙周组织的病变程度，对牙周组织具有保护作用[5]。龈沟液是来源于牙周结缔组织的渗出液，牙周组织对局部刺激的免疫反应、炎症情况以及牙周组织修复情况都可能会改变龈沟液的量及成分。

TNF-α是一种单核细胞来源的Thl型炎性因子，在牙周炎损害起重要作用，包括刺激成纤维细胞产生胶原酶，导致结缔组织的破坏和骨吸收，刺激基质细胞的凋亡从而限制牙周组织的修复，抑制成骨，提高中性粒细胞的吞噬功能促进中性粒细胞脱颗粒和分泌过氧化物酶，诱导多种细胞因子如IL-1、IL-6和IL-8等的产生从而启动炎性反应[6，7]。研究发现，牙周炎和牙龈炎患者龈沟液中的TNF-α水平高于健康者，慢性牙周炎患者龈沟液中TNFα水平与牙槽骨吸收活性呈正相关，通过治疗，龈沟液中的TNFα水平明显降低[8，9]。

IL-4是主要由活化的T细胞、单核细胞分泌的具有多种生物学功能的细胞因子，在促进以Th2细胞为特征的免疫应答过程中发挥重要作用。IL-4被认为可以通过下调巨噬细胞功能的作用及诱使单核细胞凋亡，抑制促炎因子IL-6、IL-1、TNF-α和PGE2，促进IL-l受体拮抗剂(IL-lra)的产生；有研究认为牙周炎组织中IL-4缺乏，在严重的牙周炎位点龈沟液中不能检测到IL-4，基础治疗症状缓解后，在相同位点的GCF中可检测到IL-4的存在[10，11]；而也有学者报道基础治疗控制炎症后，IL-4水平虽有升高但与治疗前无显著差异，认为这可能是因为宿主本身IL-4缺乏导致了易感人群的牙龈炎发展成了牙周炎[12，13]。

根据中医的理论，肾虚是牙周病发病的主要因素，肾主骨生髓，齿为骨之余，肾虚则齿衰，肾固则齿坚。杨霞等用益气滋肾合剂治疗大鼠实验性牙周炎发现治疗后牙齿的松动度有明显改善，外周血中TNF-α和IL-1β水平显著降低，牙槽骨的密度有一定程度的增加[14]。补肾合剂可以降低实验性牙周炎大鼠外周血中TNF-α的表达水平，改善牙周菌群和牙周状况[15，16]。许彦枝等[17]在牙周袋内应用双黄补缓释药条(主要成分为黄连、黄芩、骨碎补)治疗慢性牙周炎发现治疗后牙周指标明显改善，龈沟液中的LDH、ALP和AST水平均有明显下降。谢雁鸣等[18]研究证实骨碎补能抑制IL-6、TNF-α释放和促进IL-4分泌的作用。

多西环素不仅对多种牙周可疑致病菌有很强的抑菌作用，还能通过多种途径发挥宿主免疫调节作用。多西环素通过与胶原酶活化所必需的金属离子螯合，抑制胶原酶的产生和分泌，减轻局部组织破坏。Golub等[19]还报道了多西环素可以直接抑制牙周炎组织中中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶活性。

本实验结果表明，大鼠实验性牙周炎龈沟液中IL-4显著低于正常组，TNF-α显著高于正常。复方多西环素缓释凝胶治疗4周后，GI、PD和AL等临床指标得到明显改善，且实验组PD和AL的改善较米诺环素膏组更为明显。T组治疗后龈沟液内TNF-α水平显著降低，IL-4水平显著增高，且较米诺环素膏组增高显著。这些结果表明复方多西环素缓释凝胶通过多西环素和骨碎补的多种作用途径减轻了牙周局部炎症、结缔组织附着的丧失及牙槽骨吸收，这可能尚不能说明复方多西环素缓释凝胶的应用调节了局部牙周组织的Th1/Th2免疫应答平衡，但其对宿主局部防御调节的影响及机制值得进一步探讨。

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Effect of compound doxycycline sustained-release gel on IL-4 and TNF-αlevels in gingival crevicular fluid in rats with experimental periodontitis

CHENGFengxia,TIANHuan,WUYongsheng,etal.DepartmentofStomatology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo observe the effect of compound doxycycline sustained-release gel on gingival index (GI),depth of pocket (PD),attachment loss (AL),IL-4 and TNF-α levels in gingival crevicular fluid (GCF) of rats with experimental periodontitis.MethodsForty-two Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal control group (group N),positive control group (group C) and trial group (group T),with 14 rats in each group.After periodontitis models were established,the rats in group C were treated by minocycline ointment,however,the rats in group T were treated by compound doxycycline sustained release gel.The rats in both groups accepted treatment once a week for 4 weeks.The GI,PD,AL,IL-4 and TNF-α levels were detected and recorded before and after treatment.ResultsAfter treatment,GI,PD,AL in group C and group T were significantly decreased (P<0.05).IL-4 levels in GCF of rats with periodontitis were significantly lower than those in group N (P<0.05),however,IL-4 levels were significantly increased after treatment (P<0.05).After treatment,IL-4 levels in group T were obviously higher than those in group C (P<0.05).TNF-α levels in GCF of rats with periodontitis were significantly higher than those of group N,however,TNF-α levels were significantly decreased after treatment (P<0.05).There were no significant differences in TNF-α levels between group T and group C after treatment (P>0.05).ConclusionCompound doxycycline sustained-release gel can obviously improve clinical symptoms of periodontitis,which can obviously decrease TNF-α levels and increase IL-4 levels in GCF.

sustained-release gel; doxycycline; rhizoma drynariae; GCF; IL-4; TNF-α

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.06.002

050051 石家庄市，河北省人民医院口腔科

R 780.2

A

1002-7386(2014)06-0809-04

2013-07-11)