铜绿假单胞菌的临床分布及对环丙沙星耐药机制的研究

黄兴富,范 华

(聊城市东昌府人民医院 检验科,山东 聊城252000)

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PAE)是一种常见的革兰氏阴性杆菌,可存在于人体皮肤、呼吸道、消化道等部位,是临床最常见的条件致病菌[1]。由于抗生素及免疫抑制剂等药物的滥用,易引发机体菌群失调,导致铜绿假单胞菌感染致病；同时增强了病原菌的耐药性,使得临床治疗困难重重。了解铜绿假单胞菌的临床感染分布及耐药性特点可以更好的指导临床合理用药,控制医院感染。本研究对我院2011年9月-2013年9月收集的287株铜绿假单胞菌阳性标本的分布及耐药情况进行分析,并初步探讨了铜绿假单胞菌对环丙沙星抗菌药物的耐药机制,以期对临床合理用药提供一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1菌株来源收集了2011年9月-2013年9月我院各种临床样本分离的铜绿假单胞菌共287株。全部菌株通过法国梅里埃公司VITEK-32细菌鉴定仪进行鉴定。

1.2药敏试验采用琼脂纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验,结果以美国临床实验室标准化研究所(CLSI)公布的标准判定。并采用微量肉汤稀释法测定环丙沙星对PAE的最低抑菌浓度(MIC)。M-H琼脂及抗菌药物纸片均是英国Oxoid公司产品。以标准质控菌株铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠埃希菌(ATCC25922)作为质控菌株。

1.3基因突变分析对gyrA、gyrB、parC及parE基因喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的突变进行检测。采用煮沸法提取细菌总的DNA作为PCR模版。PCR反应条件为:94 ℃预变性5 min、94 ℃变性45s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,25个循环、72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。gyrA、gyrB、parC及parE特异性引物的合成及PCR产物的测定均由生工生物工程(上海)有限公司代为完成,所设计的引物序列如下：gurA上游：ATCACTACGGTGGCTCATTT,下游：CTTCGGTACCGTGAAGAAGA,扩增片段长度为910 bp；gyrB上游：GAAGTTCACTTCAAGCCGTC,下游：AGGAGAGCATCTTGTCGAAG,扩增片段长度为895bp；parC 上游：TCCAAAGTTCGCGGAATCCA,下游：ATCACTTAACCGGCTGGACG,扩增片段长度为398 bp；parE上游：GCATCCGCGAGGATACAGAT,下游：AGTCGGTGCAGGAAAGCTAC,扩增片段长度为691 bp。基因组提取试剂盒购自北京TIAGEN生化科技有限公司；PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.4统计分析采用SPSS16.0软件进行数据统计分析。

2 结果

2.1临床标本来源及科室分布287株铜绿假单胞菌的标本主要来源是痰液,共219例,占76.3%；其它标本依次为脓液22例,占7.7%；分泌物18例,占6.3%；尿液13例,占4.5%；血液8例,占2.8%；其他标本7例,占2.4%。而在临床科室中的分布ICU和呼吸内科依然是铜绿假单胞菌感染最多的2个科室,分别占29.3%和22.6%,在其他科室分布依次为心内科40株,占13.9%；骨科23株,占8.0%；神经内科18株,占6.3%；脑外科17株,占5.9%；肾内科14株,占4.9%；消化内科10株,占3.5%；血液科7株,占2.4%；其他科室9株,占3.1%。

2.2耐药性分析287株铜绿假单胞菌对7种临床常用抗菌药的耐药性分析见表1。铜绿假单胞菌对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦及头孢他啶敏感率均在70%以上；其次较为敏感的为氨曲南及头孢吡肟,敏感率在60%以上；而对环丙沙星耐药率较高,达44.9%,对氨苄西林的耐药率甚至高达97.9%。

表1 287株铜绿假单胞菌对7种抗菌药的耐药性分析

2.3基因突变检测对129株环丙沙星耐药的铜绿假单胞菌进行MIC检测,发现MIC≥32 μg/ml的菌株有45株,对此45株铜绿假单胞菌的gyrA、gyrB、parA及parE的QRDR进行PCR扩增及测序,结果发现,仅3株无任何基因突变,剩余42株均存在gyrA基因突变,且其中32株存在着双突变,以gyrA基因和parC基因同时突变最多,有28例。详见表2。

表2 45株环丙沙星耐药铜绿假单胞菌的QRDR错义突变分析

3 讨论

铜绿假单胞菌是目前医院感染常见的条件致病菌,可导致呼吸道、泌尿道和血液的感染[2-3],在医院感染占有重要地位[4],且其感染率近年来不断增加[5]。分析本院2011年9月-2013年9月收集的各科室共287株铜绿假单胞菌的临床分布及耐药情况,标本来源从多到少依次为痰液、脓液、分泌物、尿液和血液,其中痰液占了标本总数的76.3%。铜绿假单胞菌阳性标本的临床科室分布以ICU(29.3%)及呼吸内科(22.6%)居多,其次为心内科(13.9%)及骨科(8.0%)等科室。考虑ICU及呼吸内科患者多为老年病人,患者病程长、病情重、机体免疫力低下,在对重症患者进行抢救时常进行气管切开及插管等侵入性操作,同时这些患者往往伴有长时间的使用广谱抗菌药控制感染,极易引发机体菌群失调进而导致条件致病菌如铜绿假单胞菌感染增加。

铜绿假单胞菌具有多种获得性耐药机制,并且具有耐药性强和机制复杂的特性,同时也具有较强的环境适应能力[6]。本研究对7种临床常用的抗菌药耐药性分析显示铜绿假单胞菌对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦及头孢他啶敏感率均在70%以上；其次较为敏感的为氨曲南及头孢吡肟；而对环丙沙星耐药率较高,达44.9%,对氨苄西林几乎全部耐药。铜绿假单胞菌的耐药机制复杂,主要涉及膜孔蛋白丢失、外排泵系统、整合子系统、基因盒和β-内酰胺酶等,导致临床治疗困难,目前抗菌药应用广泛,助长了细菌产生更强的耐药性。本研究结果与国内一些报道相似[5-7],同时存在差异,郭丽等[8]研究分析显示铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为39.8%,明显高于我们的分析结果。碳青霉烯类抗菌药物是治疗铜绿假单胞菌的最有效药物之一,亚胺培南为此类抗菌药的代表性药物,有研究显示铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率在逐年增加[9],高辉等[5]对某医院2005年-2009年铜绿假单胞菌的耐药性分析显示5年内PAE对碳青霉烯类、β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类等多种抗菌药的耐药性均有不同程度的增加趋势。提示目前细菌耐药问题日趋严重,临床医师应当合理用药,规范用药,防止细菌耐药性持续升高。

由于铜绿假单胞菌对青霉素类药物耐药机制已相对明确,本研究仅对环丙沙星的耐药机制进行初步研究。通过PCR扩增及测序的方法对目的菌株的gyrA、gyrB、parC及parE基因喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的突变进行检测,在45株(环丙沙星MIC≥32 μg/ml)铜绿假单胞菌中,发现有42株均存在gyrA基因突变,且主要突变位点是第83位密码子(ACC->ATC,Thr-83->Ile),说明了gyrA基因的错义突变与对环丙沙星耐药密切相关；而MIC范围在128到256的铜绿假单胞菌株,大部分都存在gyrA与parC双突变,从而说明parC基因突变能进一步提高铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药性。但本研究未发现文献报道的gyrA基因第87位密码子单突变及83、87位密码子双突变菌株[10]。此外,还有3株铜绿假单胞菌未发现上述基因的QRDR错义突变,提示铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药情况还存在着其他机制,如主动外排系统的过度表达及膜渗透性的下降等。

细菌的耐药性问题已成为我国显著存在的医疗卫生及经济性问题[11]。抗菌药的不合理应用与菌株的耐药性升高直接相关,这应引起各级医师的高度重视,做到定期监测本地区常见病原菌的临床分布和耐药性变化,根据监测结果合理选用抗菌药,更好的遏制菌株的耐药率,提高治疗疗效。

作者简介：黄兴富(1976),男,学士,主管检验师,主要从事临床检验工作。

参考文献：

[1]吕婉飞,张媛媛,汪 丽,等.铜绿假单胞菌的临床分布与耐药性变迁[J].中华医院感染学杂志,2009,19 (23):3263.

[2]Sun HR.Pneumonia due to Pseudomonas Aeruginosa part Antimicrobial resistance,pharmacodynamic concepts,and antibiotic-therapy[J].Chest,2011,139(5):1172.

[3]Moore NM.Epidemiology and pathogenesis of pseudomonas aeruginosa infections[J].Chin Lab Sci,2011,24(1):43.

[4]辛力华,周昕,张 爽,等.2008-2009年医院感染铜绿假单胞菌的耐药分析[J].中华医院感染学杂志,2012,7(22)：1477.

[5]吴晓勇,史俊敏,伍贤鼎.385株铜绿假单胞菌临床分布与耐药性分析[J].检验医学与临床.2013,10 (1):126.

[6]黄燕新,姜朝新,王陈龙,等.464株铜绿假单胞的耐药分析及治疗[J].国际检验医学杂志,2013,6(24):752.

[7]高 辉,王 杨,黄云昆,等.2005-2009年医院感染铜绿假单胞菌的临床分布及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2011,21(7):1434.

[8]郭 丽,顾怡明,张杰,等.334株铜绿假单胞菌的耐药性分析[J].中国药房,2008,19(20):1555.

[9]谢 强,马筱玲,卜 素,等.铜绿假单胞菌临床分布及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2013,23(5):1166.

[10]Gorgani N,Ahlbrand S,Patterson A et al.Detection of point mutations associated with antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa[J].Int J Antimicrob Agents,2009,34(5):414.

[11]杨启文,徐英春,谢秀丽,等.全国10所医院院内与社区感染常见病原菌耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2009,19 (9):1133.