血清稀释与否对检测乙型肝炎核心抗体结果的影响

张碧莹，邢延芳，王珍珠，耿 丹

(1.铜川市人民医院 检验科，陕西 铜川727000；2.延安大学附属医院检验科，陕西 延安716000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界性公共卫生关注的焦点之一，全球约有3.5亿人感染，其中我国感染乙肝病毒的人口约占33%[1]。乙肝病毒血清学标志物检测是临床判断患者传染性与预后的重要指标。其中HBcAb通常在乙肝表面抗原HBsAg出现后3～5周肝炎症状出现前即可在血清中检出。高浓度的HBcAb阳性常表示乙肝病毒正在复制，有传染性。低浓度的HBcAb表示乙肝病毒既往感染，常与HBsAb阳性并存。部分接受血源性疫苗的正常人群，在乙肝表面抗体产生的同时，HBcAb也会低浓度存在。其中单项HBcAb阳性，难以确定病人是近期感染，还是既往感染，以及是否具有传染性，需要进一步检查HBV-DNA的病毒载量。目前我国主要采用ELISA法检测，HBcAb检测如做流行病学调查，可用原倍血清标本直接检测；如作为临床诊断依据，试剂盒使用说明书中建议将待测标本用生理盐水1∶30稀释后检测。笔者探讨稀释法检测过程中，低浓度的HBcAb血清标本呈假阴性的情况。以期对HBcAb检测方法进行优化，提高检测准确率。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机收集无溶血、无乳糜传染科血清标本1600例，-20℃冰箱保存。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 科美公司全自动化学发光仪，型号为CHEMCLIN600。中山大学达安基因股份有限公司实时荧光定量PCR仪，型号为DA7600。

1.2.2 试剂 北京科美生物技术有限公司HBcAb检测试剂，批号为20130427，质控液批号为20130108。中山大学达安基因股份有限公司HBV-DNA检测试剂，批号为2013014。HBV-DNA检测中值和低值的质控液批号分别为2013003、2013004。选用的全部试剂均在有效使用期限之内。检验工作严格按照标准操作步骤进行，所得结果根据试剂说明书判断。

1.3 方法

1.3.1 HBcAb的检测 采用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)对原倍血清和按1∶30稀释的标本进行HBcAb检测。

1.3.2 HBcAb的确诊 采用电化学发光法(Electro Chemiluminescence Immunoassay,ECLI)对原倍血清和稀释血清存在差异的结果进行进一步判断。

1.3.3 HBV-DNA水平定量检测 采用荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)。指定HBV-DNA定量以小于1.00×103copies/mL判定为阴性，超过该标准值者则判定为阳性。

2 结果

2.1 血清稀释对检测乙型肝炎核心抗体结果存在影响

ELISA法检测原倍血清标本和稀释血清标本，结果发现(表1)，原倍血清标本和稀释血清标本的HBcAb均为阳性的有614例，阳性率为38.4%。原倍血清标本和稀释血清标本的HBcAb均为阴性的有922例，阴性率为57.6%。原倍血清标本的HBcAb呈阳性，而稀释血清标本的HBcAb呈阴性的有64例，占总标本的4.0%。

表1 ELISA法检测原倍血清和稀释血清的结果(n=1600)

2.2 电化学发光法检测乙肝五项的结果

采用电化学发光法对HBcAb检测有差异的64例原倍血清标本进行乙肝五项检测，结果显示(表2)，原倍血清中存在3例“大三阳”患者，6例“小三阳”患者，10例单项HBcAb阳性，45例接受疫苗注射正常标本。”电化学发光法与ELISA检测原倍血清HBcAb阳性结果一致。

表2 电化学发光法检测乙肝五项(n=64)

2.3 两种方法检测稀释血清标本的结果

选取ELISA测定结果不一致的稀释标本，即原倍血清标本检测HBcAb呈阳性，而稀释血清呈阴性的标本，共计64例。经FQ-PCR法测定发现，其中2例标本的测定值>1.00×103copies/mL，检测结果判定为阳性，62例标本的测定值<1.00×103copies/mL，判定为阴性。这是ELISA稀释法未检测出的2个标本，漏检率为3.1%。虽然按1∶30稀释的血清标本与原倍血清标本相比，不存在统计学差异，但在一定程度上会造成漏诊也是值得探讨和思考的问题。

3 讨论

HBV病毒属正嗜肝病毒属，是乙肝病毒性肝炎的病原体。抗-HBc是HBcAg的相应抗体，也是HBV感染后血清中最早出现的HBV、在人群检出率最高的标志性抗体[2]。其持续时间长，甚至终身存在。几乎所有个体在接触HBV后都能产生抗-HBc，故它是HBV流行病学调查的良好指标。高浓度的抗-HBc见于急、慢性肝炎和HBsAg 携带者，并表明HBV复制可能仍活跃，血清具有传染性。低浓度的抗-HBc则表示既往感染过HBV，一般无传染性。抗-HBc不是保护性抗体，一些资料和研究表明其可调节感染肝细胞表面HBsAg 表达，从而影响杀伤性T细胞对靶细胞的影响。临床上还常遇到单项HBcAb阳性的情况(0.9%-11.9 %) 其原因有：(1)急性感染恢复的早期，HBsAg减少或消失，而抗-HBc 尚未产生，即所谓的“窗口期”。(2)被动获得的抗-HBc(母婴传播)。(3)远期感染伴抗-HBc消失。(4)远期感染伴低水平HBsAg。抗-HBc阳性有助于发现HBsAg阴性的HBV感染者和携带者，有助于献血员的筛查，以确保临床用血安全，有助于确诊处于窗口期的急性乙型肝炎[3]。因此，正确报告HBcAb的结果显得尤为重要[4]。

对于抗-HBc的ELISA检测存在一个常见问题，即以ELISA为方法学原理的试剂盒说明书采用1∶30的稀释血清标本检测HBcAb，这是基于普遍认为检测原倍血清标本作为流行病学调查结果，而将待测血清标本1：30稀释后检测作为临床诊断依据，其理论依据是不充分的。如此造成一定程度的漏检，可能与标本稀释倍数偏高有关[5]。本研究结果表明，有差异的64例原倍血清样本，经ELISA法和电化学发光法检测，两种方法检测的阳性率吻合。原倍血清按1:30稀释后，HBcAb检测阴性的标本再用PQ-PCR检测，检出2例HBV-DNA阳性的标本，分别对应“大三阳”和单项HBcAb阳性的两个标本。稀释法检测HBcAb假阴性的问题易造成单项HBcAb阳性的患者漏诊。这对临床确诊、献血员筛选以及院内感染的监控可能造成影响。因此，在实际工作中，结合HBV-DNA检测十分必要。

血清HBV-DNA水平是判断HBV复制活动最直接和最可靠的标志，其定量检测对于了解HBV感染者的传染性和正确判断抗病毒治疗疗效具有重大意义[6]。2009年全国702家医疗机构参加卫生部质评活动的结果表明[7]，HBV-DNA准确率>99%，免疫静默感染以及罕见的亚型与变异，是HBV-DNA低浓度感染者被漏检的原因[8]，故检测HBV-DNA具有实际意义，但HBV-DNA检查作为常规项目还需要不断探索。ELISA法和电化学发光法是目前常用的方法，但不能全面了解HBV感染及活动状态。临床上已普遍认可，PCR检测HBV-DNA能真实反映HBV在体内复制与传染性。HBsAg浓度低于检测下限，HBsAg阴性而HBV-DNA阳性的检测结果会对安全输血造成严重威胁，目前防止输血传播乙肝的唯一措施是检测HBsAg。HBcAb检出比HBsAg更敏感，高浓度者提示有HBV活动感染；低浓度者则可能是HBV感染已恢复的标志。因此准确检测HBcAb，结合流行病学调查，以检查HBsAg阴性者中HBV的感染。

乙肝标志物临床意义各异，单凭某项指标很难全面诊断病情，试剂盒的测定结果仅作为患者总体临床评估的一部分，只有综合多项指标及HBV-DNA的检查结果，并结合临床情况，才能判断传染性的大小和病情的轻重。通过乙肝标志物的检测，还可考察乙肝疫苗接种后的免疫效果，也可作为治疗乙型肝炎疗效评价的重要指标。

参考文献：

[1]Tankijvanich P，Sa-Nguanmoo P，Mahachai V，et al.A case-control study on sequence variations in the enhancer Ⅱ/corepromoter/precore and X genes of hepatitis B virus in patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatol Int，2010，4(3)：577.

[2]Qiao CX，Zhai XF，Ling CQ，et al.Health-related quality of life evaluated by tumor node metastasis staging system in patients with hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol，2012，18(21)：2689.

[3]杨 娜，何丽萍.264例单独核心抗体阳性的HBsAg阴性血液检测分析[J].检验医学与临床，2010,7(20)：2275.

[4]黄云英，黄丽敏，黄鹤鸣，等.三种方法检测乙型肝炎病毒核心抗体结果的比较[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2005,26(5)：320.

[5]徐建华，黄宪章，庄俊华，等.罗氏Modular全自动生化分析仪酶学指标检测性能验证[J].检验医学，2010，25(2)：81.

[6]谭朝霞，况雪梅，丁世涛，等.慢性乙型肝炎患者5年阿德福韦酯疗程中HBsAg水平变化及其与HBV-DNA水平相关性分析[J].国际检验医学，2012，33(22)：2695.

[7]彭俊华，常亚丽，柴玉香，等.乙肝病毒DNA、前S1抗原及核心抗体IgM的临床应用[J].西北国防医学杂志，2013,34(5)：407.

[8]吴玉清，郭 建，李金明，等.混合核酸检测法筛查HBV窗口期献血者[J].中华检验医学杂志，2008,31(5)：566.