青岛地区大肠埃希菌临床株中blaCTX-M和PMQR基因的检测

尉鸿飞，牟晓东，朱元祺，马金龙，赵静宜*，刘新利

(1.齐鲁工业大学 山东省微生物工程重点实验室，山东 济南250353;2.中国石油大学(华东)化学工程学院 生物工程与技术中心，山东 青岛266580;3.青岛大学医学院附属医院 检验科，山东 青岛266003)

大肠埃希菌是临床肠杆菌科细菌中常见的机会致病菌，头孢菌素类和氟喹诺酮类药物是两种临床应用最广泛的抗生素，过度使用导致了耐药菌的逐渐增加。国内传播最广泛的头孢菌素耐药基因是blaCTX-M，该基因常常位于可移动质粒上，造成头孢菌素耐药性在不同细菌间水平传播。细菌对氟喹诺酮类药物的耐药性包括染色体编码的垂直耐药性和质粒介导的传播耐药性两种机制。由于质粒能够加速耐药基因在临床病原菌中的传播，因而，质粒介导的喹诺酮耐药性(plasmid mediated quinolone resistance，PMQR)在近十年中引起了全球关注。迄今PMQR已经报导了三种机制：qnr基因编码的靶酶保护机制，aac(6’)-Ib-cr基因编码的药物失活机制，qepA和oqxAB基因编码的药物外排机制。这三种机制已经在世界范围30多个国家的临床和环境分离肠杆菌中检测到[1]。

前期研究发现，许多临床分离的大肠埃希菌可对头孢菌素类和氟喹诺酮类药物同时耐药，多种PMQR基因与bla基因组合在菌株中被检测到[2]，这将促进临床病原菌多重耐药性的产生，进而加剧细菌感染控制和治疗的难度。本研究旨在调查青岛地区大肠埃希菌临床分离株中blaCTX-M基因和PMQR基因的流行性，为医院感染控制和临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

107株大肠埃希菌于2012年采自青岛大学医学院附属医院的门诊和住院患者。采集样品来自不同的临床标本，包括血液、胆汁、胸腹水、导管、咽拭子、脓疮或伤口等。细菌鉴定采用Vitek-2 Compact全自动微生物分析系统，细菌耐药性检测判定标准参照美国临床和实验室标准协会(CLSI 2010)进行，以EscherichiacoliATCC25922 和KlebsiellapneumoniaeATCC700603作为质控菌株。

1.2 主要培养基与生化试剂及仪器

离心柱型-基因组提取试剂盒和电泳级琼脂糖(北京天根生化科技有限公司)、PCR试剂盒和核酸分子量标准及限制性内切酶FokI(大连宝生物工程有限公司)、Mueller-Hinton培养基(英国Oxoid公司)、PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)、全自动凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)、Vitek-2 Compact全自动微生物分析系统(法国Biomérieux公司)。

1.3 blaCTX-M基因和PMQR基因的检测

使用离心柱型-基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，blaCTX-M基因和PMQR基因筛选引物参照文献报道[3-5](见表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以细菌基因组DNA为模板，PCR检测菌株带有的blaCTX-M基因和各种PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA及oqxB基因)，选取代表性的PCR产物进行DNA序列测定。对于aac(6’)-Ib-cr基因，PCR技术[5]检测菌株带有的aac(6’)-Ib基因，阳性菌株的基因扩增产物使用限制性内切酶FokI处理并进行DNA序列测定，鉴定cr变体。

表1 本研究使用的引物信息

2 结果

2.1 大肠埃希菌临床分离株的药敏试验结果

107株大肠埃希菌均对氨苄西林耐药，95%的菌株对头孢噻肟、头孢唑啉和头孢曲松耐药，88%和82%的菌株分别对环丙沙星和左氧氟沙星耐药。89株细菌同时对头孢菌素类及氟喹诺酮类药物耐药。详见表2。

表2 大肠埃希菌对临床常用抗生素耐药结果(n=107)

2.2 blaCTX-M基因和PMQR基因的检测结果

在107株临床分离大肠埃希菌中，90株菌带有blaCTX-M基因，64株菌带有一种或多种PMQR基因。其中，3株带有qnrB基因，6株带有qnrS基因，41株带有aac(6’)-Ib-cr基因，5株带有qepA基因，25株带有oqxAB基因。qnrA、qnrC、qnrD基因未检测到。值得注意的是，60株菌同时带有blaCTX-M和PMQR基因，其中有10株同时带有两种PMQR基因，包括3株带有aac(6’)-Ib-cr和qnrS基因，3株带有aac(6’)-Ib-cr和qepA基因，两株带有aac(6’)-Ib-cr和qnrB基因，两株带有aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因；3株同时带有三种PMQR基因，包括1株带有aac(6’)-Ib-cr、qnrB和oqxAB基因，1株带有aac(6’)-Ib-cr、qnrS和oqxAB基因，1株带有aac(6’)-Ib-cr、qepA和oqxAB基因。各种耐药基因的PCR扩增产物电泳检测结果见图1。

图1 耐药基因PCR扩增产物电泳结果

M：100 bp DNA Ladder；0：阴性对照；1：blaCTX-M基因(551 bp)；2：qnrB基因(264 bp)；3：qnrS基因(428 bp)；4：aac(6’)-Ib-cr基因(482 bp)；5：qepA基因(218 bp)；6：oqxA基因(392 bp)；7：oqxB基因(512 bp)。

3 讨论

在本研究中，我们对青岛地区临床分离的107株大肠埃希菌进行了头孢菌素类和氟喹诺酮类药物的耐药性测定。结果表明，83%的菌株同时对头孢菌素类和氟喹诺酮类药物耐药，说明分离的大肠埃希菌中存在多种耐药基因。考虑到质粒介导的耐药基因更易引起细菌耐药性传播以及blaCTX-M和PMQR基因的广泛流行，我们对细菌分离株进行了blaCTX-M基因和四类PMQR基因的检测。

超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase，ESBL)是引起肠杆菌科细菌对头孢类抗生素耐药的主要机制，而头孢噻肟高水解酶基因blaCTX-M是我国主要流行传播的ESBLs基因[6]。王凤平等[7]的调查显示，在产ESBLs的大肠埃希菌中，主要是CTX-M型。在本研究中，95%的菌株对头孢噻肟耐药，blaCTX-M基因在84%的菌株中被检测到，是流行性很高的ESBL基因。

超过80%的菌株对环丙沙星或左氧氟沙星耐药，并且60%的菌株带有PMQR基因。其中aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因流行性最高。38%的菌株带有aac(6’)-Ib-cr基因，远高于浙江温州[8]该基因的流行率(7%)。在临床菌株中oqxAB基因相较其他PMQR基因报道较少，本研究中23%的菌株带有oqxAB基因，远高于上海[9]该基因的流行率(6.6%)。56%的菌株同时带有blaCTX-M和PMQR基因，这将更有利于多重耐药性的传播，进而增加细菌性感染治疗的难度。

综上，本研究得到如下结论：首次证实blaCTX-M基因和PMQR基因在青岛地区临床分离大肠埃希菌中广泛流行，且常共存于菌株中。这将加速该地区多重耐药菌的产生并增加细菌性感染治疗的难度。因而，增加对临床多重耐药菌及耐药基因共存的检测，通过合理使用抗生素，防止耐药菌株的扩散，避免多重耐药菌的产生及传播非常紧迫。

作者简介：尉鸿飞(1986-)，男，在读硕士研究生，主要研究方向：微生物学与分子生物学。

参考文献：

[1]Strahilevitz J,Jacoby GA,Hooper DC,et al.Plasmid-mediated quinolone resistance:a multifaceted threat [J].Clin Microbiol Rev,2009,22(4):664.

[2]Liu BT,Liao XP,Yue L,et al.Prevalence of β-lactamase and 16S rRNA methylase genes among clinical Escherichia coli isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance genes from animals[J].Microb Drug Resist,2013,19(3):237.

[3]Dutour C,Bonnet R,Marchandin H,et al.CTX-M-1,CTX-M-3,and CTX-M-14 β-lactamases from Enterobacteriaceae isolated in France [J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(2):534.

[4]Kim HB,Wang M,Park CH,et al.oqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae [J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(8):3582.

[5]Zhao JY,Dang H.Coastal seawater bacteria harbor a large reservoir of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in Jiaozhou Bay,China [J].Microb Ecol,2012,64(1):187.

[6]李家斌，李 惠，李 旭，等.合肥市产超光谱β-内酰胺酶菌株CTX-M型耐药基因的初步分布[J].中华医院感染学杂志,2004,14(9):965.

[7]王凤平，陈 清，吴奎海，等.临床分离大肠埃希菌耐药机制和基因分型研究[J].中国实验诊断学,2011,15(2):293.

[8]张雪青，陈增强，陈俐丽，等.大肠埃希菌临床分离株aac(6’)-Ib-cr基因的检测[J].中国卫生检验杂志,2008,18(7):1266.

[9]Yuan J,Xu X,Guo Q,et al.Prevalence of the oqxAB gene complex in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli clinical isolates [J].J Antimicrob Chemother,2012,67(7):1655.