卡托普利对压力负荷增加大鼠血清TNF-α表达的影响

赵智明 张静 董晓蕾 赵凌杰 蔡辉

·论著·

卡托普利对压力负荷增加大鼠血清TNF-α表达的影响

赵智明 张静 董晓蕾 赵凌杰 蔡辉

目的观察卡托普利对压力负荷增加大鼠血清TNF-α表达水平的影响。方法采用腹主动脉缩窄术制备压力负荷心肌纤维化模型，随机分成3组：假手术组、模型组和卡托普利组。术后4周成功造模并开始给药，疗程4周。8周后观察3组心脏质量指数和左心室质量指数、HE染色法观察左心室心肌病理学、Masson染色法观察左心室心肌胶原形态，图像分析测量胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)，ELISA法测定大鼠血清TNF-α的含量。结果与假手术组比较，模型组大鼠心脏质量指数和左心室质量指数均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组则均显著降低(P<0.01)。与假手术组比较，模型组大鼠CVF和PVCA均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组则均显著降低(P<0.01)。与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组则显著降低(P<0.01)。结论卡托普利具有逆转心肌纤维化的作用。

卡托普利；压力负荷；肿瘤坏死因子-α；大鼠

高血压心肌纤维化心力衰竭是一个渐进过程，控制心肌纤维化和心室重构在高血压性心脏病发展过程中成为关键。TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，可通过诱导心肌细胞肥大、细胞凋亡和调节细胞外基质合成等多种途径参与心室重构发生和发展[1]。本研究以压力负荷增加诱导心肌纤维化模型，观察血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利对血清TNF-α的影响，并探讨其意义。

1.1 实验动物 清洁级6周龄Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量160～200 g[许可证号：SYXK(苏)2003-0032]，我院动物实验中心提供。动物饲养室温(23±3)℃，周期光照8∶00～20∶00，饲料、垫料高压灭菌，常规饲料喂养，自由进食、饮水。

1.2 药品与试剂 卡托普利片，12.5 mg/片，中美上海施贵宝制药有限公司；TNF-α测定试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司(批号：KGERC102a)。

1.3 实验方法

1.3.1 心肌纤维化模型制备及分组:采用Anversa等[2]方法用腹主动脉缩窄术制备压力负荷增加心肌纤维化模型。大鼠适应性喂养5 d后，术前禁食12 h，自由饮水，手术组用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常规备皮消毒后，于剑突下沿腹正中线逐层开腹，在肾动脉上方分离腹主动脉，在肾动脉上方0.5 cm用内径0.70 mm银夹夹闭，使腹主动脉缩窄60%～70%，确认无出血，将脏器复位后逐层关闭腹腔，术后给予青霉素10万U/kg肌内注射抗感染3 d，6 h后恢复饮食。造模成功标准：大鼠心脏质量指数(HWI)和左心室质量指数(LVWI)均明显升高。假手术组不结扎腹主动脉，余处理同上。取术后存活大鼠24只，随机分为3组，每组8只，分别为假手术组、模型组和卡托普利组。

1.3.2 给药及分组:卡托普利组给予卡托普利100 mg·kg-1·d-1灌胃，3组每天上午给药1次，连续给药4周。假手术组及模型组均给予0.9%氯化钠溶液1.5 ml·kg-1·d-1灌胃，连续4周。观察3组大鼠的饮食、毛色、活动、水肿等一般性状，每周称体重(BW)。

1.3.3 HWI及LVWI测定:术后8周末，禁食12 h，将3组大鼠称重后采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，取血完毕后，迅速开胸摘取心脏，于4℃ 0.9%氯化钠溶液中洗去血液，滤纸吸干，除去心脏周围组织和大血管，称取心脏质量(HW)，再剪去左右心房、右心室游离壁保留左心室及室间隔，称取左心室质量(LVW)。分别计算HWI(HWI=HW/BW)和LVWI(LVWI=LVW/BW)，以HWI和LVWI作为判断心肌肥厚的指标。透壁剪取左心室心尖部分组织投入液氮中留待检测其他指标，其余标本放于4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.4 形态学检测:心肌标本于甲醛中固定24 h后，常规取材、脱水、石蜡包埋，沿左室长轴线每隔1 mm横断面切取数张4 μm厚的切片，作HE染色观察心肌组织形态学改变。Masson染色观察心肌间质和血管周围胶原沉积情况，Masson染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。应用Image-pro Plus Version 6.0软件进行测量心肌胶原容积分数(CVF)和心肌血管周围胶原面积和管腔面积之比(PVCA)。其中CVF=心肌胶原面积/所测视野面积，PVCA=小动脉管腔周围胶原面积/管腔面积，每张心肌切片标本随机取4个视野测量，取其平均值。

1.3.5 血清TNF-α浓度的测定:采取静脉血，常规离心分离血清，存放于-20℃冰箱，ELISA法测定TNF-α，严格按试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 大鼠一般状态 术后第1周模型组和卡托普利组动物均精神萎靡，活动量减少，毛色暗淡，摄食及饮水减少，1周后好转。整个实验期间，假手术组大鼠一般状况良好，对外界刺激反应灵敏，行动敏捷，毛色光泽，摄食及饮水正常，与术前未见明显差别；模型组大鼠后期精神萎靡，行动迟缓，倦卧，毛色逐渐失去光泽；而卡托普利组大鼠的一般状况较模型组明显好转。

2.2 HWI和LVWI测定结果 与假手术组比较，模型组的HWI和LVWI均显著增大(P< 0.01)；与模型组比较，卡托普利组的HWI和LVWI显著下降(P< 0.01)。见表1。

2.3 心肌组织病理学结果 光镜下观察可见：假手术组大鼠心肌纤维排列整齐，横纹明显，胞核结构清晰，无细胞肿胀，心肌间质及微血管结果正常；模型组大鼠心肌纤维明显增粗，排列紊乱、部分心肌细胞水肿、浅染，横纹模糊，偶见心肌断裂，肌束间隙呈不同程度增大，胞核固缩，部分出现局灶性、片状坏死，间质可见炎性细胞浸润；卡托普利组有显著改善。Masson染色结果显示：胶原纤维呈蓝色，心肌细胞呈红色。可见，与假手术组比较，模型组心肌间质和血管周围胶原沉积明显增加，而卡托普利组胶原沉积显著减轻。与假手术组比较，模型组大鼠CVF 和PVCA 均显著升高(P< 0.01)；与模型组比较，卡托普利组大鼠CVF和PVCA均显著下降(P<0.01)。见图1、表1。

A、D、G：假手术组；B、E、H：模型组；C、F、I：卡托普利组

2.4 TNF-α测定结果 造模8周时，与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α浓度明显增高(P< 0.01)；与模型组比较，卡托普利组大鼠血清TNF-α浓度显著降低(P< 0.01)。见表1。

组别HWI(mg/g)LVWI(mg/g)CVF(%)PVCA(%)血清TNF⁃α(pg/ml)假手术组2．63±0．132．08±0．113．55±0．370．61±0．067．31±0．72模型组3．23±0．25∗2．75±0．20∗7．04±0．65∗1．58±0．19∗25．77±0．94∗卡托普利组2．82±0．32#2．29±0．29#4．21±0．27#0．93±0．13#11．83±0．84#

注：与假手术组比较，*P< 0.01；与模型组比较，#P< 0.01

3 讨论

心室重构是原发性高血压导致的重要靶器官损害，是心脏功能由代偿走向失代偿的重要病理基础[3]。神经体液因素在心室重构发生发展过程中起着关键作用，以TNF-α为代表的促炎细胞因子与心血管系统疾病密切相关。研究显示，高血压患者血清促炎细胞因子表达显著上调，并且促炎细胞因子与高血压预后密切相关[4]。

TNF-α主要由单核-巨噬细胞分泌[5]，另有研究发现心肌细胞本身也是TNF-α分泌的主要来源[6]，压力负荷可诱导这些细胞表达TNF-α。Nagueh等[7]研究发现压力负荷可造成TNF-α分泌，长时间TNF-α刺激可导致心肌纤维化和心肌肥厚。TNF-α可通过多种方式调节心肌纤维化。TNF-α可促进心脏成纤维细胞增殖[8]，直接作用于成纤维细胞，导致胶原纤维合成和分泌增多，并上调成纤维细胞上的血管紧张素Ⅱ1型受体，从而增加血管紧张素Ⅱ促纤维化的作用[9]，TNF-α还可通过动态调控金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂的比值而影响胶原的降解，并可通过上调转化生长因子-β的表达而间接地促进心肌纤维化[10]。

本结果表明，模型组HWI和LVWI高于假手术组；模型组CVF 和PVCA较Sham组增加；Model组血清TNF-α较假手术组增加，提示胶原网络增生并参与压力负荷增加下的心室重构；可能是压力增加导致心肌组织中TNF- α mRNA转录和蛋白合成增加，进入血液循环中的TNF-α增加，进一步通过上述途径刺激心肌纤维化产生。造模成功后进一步给予卡托普利100 mg·kg-1·d-1灌胃4周后发现，结果显示，与模型组比较，卡托普利组HWI和LVWI、CVF 和PVCA以及血清TNF-α明显降低。因此，可以认为卡托普利可通过降低压力负荷增加大鼠血清TNF-α水平改善心肌纤维化。

1 Rosello-Lleti E,Rivera M,Martinez-Dolz L,et al.Inflammatory activation and left ventricular mass in essential hypertension.Am J Hypertens,2009,22:444-450.

2 Anversa P,Olivetti G,Melissari M,et al.Morphometric study of myocardial hypertrophy induced by abdominal aortic stenosis.Lab Invest,1979,40:341-349.

3 Buja LM,Vela D.Cardiomyocyte death and renewal in the normal and diseased heart.Cardiovasc Pathol,2008,17:349-374.

4 Pedrinelli R,Dell'Omo G,Di Bello V,et al.Low-grade inflammation and microalbuminuria in hypertension.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:2414-2419.

5 赵智明,蔡佳玉,焦冬冬,等.淫羊藿总黄酮对充血性心力衰竭大鼠血浆TNF-α的影响.安徽中医学院学报,2010,29:59-63.

6 Zhang J,Cheng X,Liao YH,et al.Simvastatin regulates myocardial cytokine expression and improves ventricular remodeling in rats after acute myocardial infarction.Cardiovasc Drugs Ther,2005,19:13-21.

7 Nagueh SF,Stetson SJ,Lakkis NM,et al.Decreased expression of tumor necrosis factor-alpha and regression of hypertrophy after nonsurgical septal reduction therapy for patients with hypertrophic obstructive cardiomyopathy.Circulation,2001,103:1844-1850.

8 Venkatachalam K,Venkatesan B,Valente AJ,et al.WISP1,a pro-mitogenic,pro-survival factor,mediates tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha)-stimulated cardiac fibroblast proliferation but inhibits TNF-alpha-induced cardiomyocyte death.J Biol Chem,2009,284:14414-14427.

9 Peng J,Gurantz D,Tran V,et al.Tumor necrosis factor-alpha-induced AT1 receptor upregulation enhances angiotensin II- mediated cardiac fibroblast responses that favor fibrosis.Circ Res,2002,91:1119-1126.

10 Sivasubramanian N,Coker ML,Kurrelmeyer KM,et al.Left ventricular remodeling in transgenic mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor.Circulation,2001,104:826-831.

·消 息·

本刊对统计学符号及统计学方法的要求

本刊编辑部

EffectofcaptoprilontheexpressionlevelsofserumTNF-αinratswithpressureoverload

ZHAOZhiming,ZHANGJing,DONGXiaolei,etal.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Nanjing210002,China

ObjectiveTo observe the effect of captopril on the expression levels of serum TNF-αin rats with pressure overload.MethodsThe animal models with pressure overload myocardial fibrosis were established by abdominal aorta constriction in Sprague-Dawley (SD) rats.The rats were randomly divided into three groups:sham-operation group,model group and captopril group.After 4 weeks,the models were successfully established and the rats were given drugs,with a treatment course of 4 weeks.After 8 weeks the heart mass index and left ventricular mass index were measured,left ventricular myocardial pathological changes were observed by means of HE staining,left ventricular myocardial collagen forms were observed by means of Masson staining,and image analysis collagen volume fraction (CVF) and perivascular collagen area (PVCA) were measured by image analysis,and the levels of serum TNF-α were detected by ELISA.ResultsAs compared with those in sham-operation group,the heart mass index and left ventricular mass index were significantly increased in model group (P<0.01);as compared with those in model group,which in captopril group were significantly decreased (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,CVF and PVCA in model group were significantly increased (P<0.01); as compared with those in model group,which in captopril group were significantly decreased (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,the serum levels of TNF-αwere obviously increased in model group (P<0.01);as compared with those in model group,which in captopril group were significantly decreased (P<0.01).ConclusionThe captopril has the effect of regressing myocardial fibrosis.

captopril; pressure load;TNF-α;rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.008

210002 南京市,中国人民解放军南京军区南京总医院中西医结合科

蔡辉，210002 中国人民解放军南京军区南京总医院；

E-mail：caihuiphd@163.com

R 542.23

A

1002-7386(2014)05-0665-03

2013-10-18)