黄连与生地及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞脂联素与瘦素分泌的影响*

杨明炜 王志伟 陆付耳 刘艳娟

华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所，武汉 430030

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病、肥胖、原发性高血压、高脂血症、冠心病等多种疾病的共同病理生理学基础[1]，因此，IR的发病机制研究以及改善IR的药物探索一直是近年来医学领域研究的热点。近年来，研究发现胰岛素信号转导障碍、脂肪源性细胞因子表达异常在IR发生过程中扮演了重要的角色，而且越来越多的研究认为脂肪组织是IR产生的始发部位[2]。本实验通过观察比较黄连、生地及其配伍含药血清对IR 3T3-L1脂肪细胞脂联素与瘦素分泌的影响，从脂肪细胞因子途径探讨黄连、生地及其配伍改善IR的作用机制，并通过比较黄连、生地及其配伍对上述脂肪细胞因子作用的选择性或协同性，揭示黄连生地药对的配伍原理。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验动物

3T3-L1小鼠前脂肪细胞株购自于中国科学院细胞库。雄性Wistar大鼠24只(SPF级)，购自湖北省实验动物研究中心，体重约220 g。

1.2 受试药品

罗格列酮、胰岛素、地塞米松与牛血清蛋白(BSA)购自美国Sigma公司，胎牛血清与DMEM/HIGH GLUCOSE培养液购自Thermo公司；葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)购自上海名典生物工程有限公司，ELISA试剂盒购自CUSABIO公司。

1.3 含药血清的制备

选择雄性Wistar大鼠40只，SPF级，适应性普通喂养2周后，体重约达(330±15)g。将所有大鼠随机分为黄连组、生地组、黄连+生地组和空白血清组，每组10只，药物干预组大鼠分别灌服相应剂量的中药汤剂，其中黄连1.58 g/kg，生地0.63 g/kg(黄连、生地的剂量分别为临床剂量的60倍)，空白血清组大鼠灌服相同剂量的生理盐水。每组灌胃2次/d，8 h/次，期间禁食不禁水，第3天灌胃结束1 h后，于无菌条件下腹主动脉取血，然后放入台式高速离心机3 000 r/min离心15 min，取血清，将其放入56 ℃恒温水浴锅灭活，-20 ℃冰箱保存1个月内用完。

1.4 前脂肪细胞的培养和诱导分化

按文献[3]所述，将3T3-L1前脂肪细胞接种于24孔培养板，用含10% FBS的高糖DMEM培养液在37 ℃，5% CO2条件下培养，每2 d换液。待细胞完全融合后继续接触抑制2 d，换以含0.5 mmol/L IBMX，0.25 μmol/L地塞米松，1 μg/ml胰岛素的10% FBS高糖DMEM培养液培养48 h，换以含1 μg/ml胰岛素的培养液再培养48 h，随后以10%胎牛血清高糖DMEM培养液继续培养，分化8～10 d的细胞表现为成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

1.5 模型的建立及分组处理

将诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞换上含2 g/L BSA的DMEM无血清培养液培养12 h后，分别换上含25 mmol/L葡萄糖，0.6 nmol/L胰岛素，10 g/L BSA的DMEM培养液培养18 h，完成IR细胞模型的建立[4]。将IR细胞分为模型组及各药物干预组，药物干预组分为罗格列酮组、黄连组、生地组及黄连+生地组，分别以马来酸罗格列酮(Rosiglitazone Maleate)溶液、黄连含药血清、生地含药血清及黄连、生地配伍含药血清进行干预24 h，另设空白血清对照组(以不含药血清进行干预)及正常组(正常脂肪细胞)。收集各组细胞培养液上清，检测相关指标。

1.6 葡萄糖消耗实验

以葡萄糖氧化酶法检测每孔培养液中葡萄糖的含量，与未接种细胞的空白孔的糖含量均值相减，计算葡萄糖的消耗量。

1.7 检测细胞脂联素与瘦素的分泌水平

采用ELISA法检测。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 黄连、生地及其配伍含药血清对IR 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量的影响

与正常组比较，模型组葡萄糖消耗量明显减少(P<0.01)；与模型组比较，空白血清组葡萄糖消耗量无明显变化(P>0.05)，黄连组、生地组、黄连+生地组、罗格列酮组葡萄糖消耗量显著增加(P<0.01)，其中黄连+生地组葡萄糖消耗量明显大于黄连、生地各单药组(P<0.01)。见表1。

表1 各组细胞葡萄糖消耗量的比较

2.2 黄连、生地及其配伍含药血清对IR 3T3-L1脂肪细胞脂联素与瘦素分泌的影响

与正常组比较，模型组脂联素水平显著降低(P<0.01)，瘦素水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，生地组、黄连+生地组脂联素分泌显著升高(P<0.01)，瘦素分泌显著降低(P<0.05，P<0.01)，黄连组脂联素、瘦素分泌均无显著差异(P>0.05)，其中黄连+生地组脂联素、瘦素分泌与单药生地组无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞脂联素与瘦素分泌水平的比较

3 讨论

IR是2型糖尿病、代谢综合征、心脑血管病等重大慢性疾病发病的共同病理生理学基础，其本质为单位胰岛素的生物效应降低，研究表明，IR常先于上述多种疾病而先行存在多年，因此，早期发现并改善IR具有重大的临床意义。脂肪组织与IR的关系已经成为国内外专家研究的重要课题，其分泌的多种脂肪细胞因子和炎症因子已被证明与IR的发生发展具有相当紧密的联系，其中，脂联素为脂肪组织分泌的一种分子量为28 kD的凝胶结合蛋白，具有提高葡萄糖摄取、促进糖代谢、抑制内皮细胞炎症、改善IR、增加脂肪酸氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎的作用[5-6]，脂联素水平与改善IR程度密切相关，脂联素水平升高可增加胰岛素敏感性，明显改善IR，反之脂联素水平减低甚至可能是2型糖尿病的预报因子。瘦素是肥胖基因(ob-gene)的蛋白产物，作为一种代谢激素，瘦素可对一系列的代谢过程产生影响，如胰岛素释放、葡萄糖的产生、转运、代谢及脂肪的分解、合成等[7]，研究[8]显示，2型糖尿病患者的血清瘦素水平与IR密切相关。

中医古代文献中虽无IR的记载，但对于IR相关疾病的诊治有着系统的理论知识和丰富的临床经验，尤其是对于糖尿病(中医称之为“消渴”，其基本病机为阴虚燥热)的治疗，历代医家总结出了大量有效验方。近年来，医者对这些验方进行比较分析，发现大多含有黄连、生地二味中药(其中生地还被誉为治疗糖尿病四大“圣药”之一)，黄连、生地配伍是临床上治疗糖尿病最常用的药对之一，其源自于孙思邈《千金要方》，称之为黄连丸，方中黄连清热为君，生地滋阴为臣，共奏滋阴清热之功效，主治消渴。临床实践[9-11]表明以黄连丸为基本方的一些制剂治疗2型糖尿病具有良好疗效，初步实验研究[12]表明，黄连丸具有明显的降糖作用。由于IR贯穿于2型糖尿病发生发展的全过程，故多数学者推测中医药治疗2型糖尿病的主要机制与改善IR有关，并对此进行了大量研究。同时，由于“药有个性之特长，方有合群之妙用”，“七情合和”、“君臣佐使”等配伍理论是在历代医药学家广泛实践的基础上发展成熟的，有着深刻的科学内涵，提示黄连伍用生地应有协同作用，其协同作用的机制何在目前却不清楚，也是亟待解答的问题。

本研究结果表明，黄连、生地及其配伍能够提高IR脂肪细胞葡萄糖消耗能力，且配伍效果更好，能促进IR脂肪细胞脂联素的分泌，减少瘦素的分泌，这可能是上述药物改善IR的作用机制之一。此外，结果还表明，黄连、生地配伍改善IR的作用环节较各单药组更广泛，作用强度较各单药组更强，提示黄连生地配伍对上述脂肪细胞因子的影响具有协同作用，说明黄连生地配伍具有科学性。

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