甲胎蛋白异质体和甲胎蛋白信使核糖核酸用于诊断肝细胞癌

邱大鹏 韩风 贺涛

肝细胞癌（HCC）是临床常见恶性肿瘤，疾病进展快，病情危重，侵袭性较强，预后较差，患者生活质量受到明显下降。近年来我国发病率明显升高，肝细胞癌由多种方式因素引起，乙型肝炎病毒感染、肝硬变等均是导致疾病发生的重要原因。甲胎蛋白（AFP）作为诊断HCC的重要指标，在临床广泛使用，然而对肝癌的特异性及敏感性均较低，因此探讨更为有效的诊断方法，研究更为敏感、特异的肿瘤标志物对于提高诊断率，提高患者生存率有着重要作用[1]。临床研究显示，多种肿瘤标志物联合检测效果明显优于单独检测，特异性及敏感性更高，笔者对2005年4-7月收治的82例HCC患者进行AFPmRNA联合甲胎蛋白（AFP）异质体AFP-L3）检测，对其与HCC的诊断及预后关系进行探讨，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2005年4-7月本院部分住院患者血清资料库中的112份血清标本，其中男76例，女36例，年龄30～73岁；平均（45.62±6.2）岁；肝脏良性病变19例（其中2例炎性假瘤，3例血管平滑肌脂肪瘤，2例灶性结节性增生，12例血管瘤），肝硬化合并门脉高压（LC）11例，HCC82例。患者均经术后病理学诊断确诊，为了排除其他因素对肝癌预后分析的影响，将HCC患者的入选标准定为：单发肿瘤<5 cm，或多发肿瘤直径之和<5 cm，无癌栓，肝功能在Child B级以上。

1.2 试剂与仪器 采用武汉中美科技有限公司生产的USCNLIFE SCIENCE人小扁豆素结合型甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）酶联免疫吸附测定试剂盒，郑州久是生物技术有限公司生产的探针及引物，BIO-RAD M680酶标仪，HH-42三用恒温水箱，Himac CR 21G低温高速离心机，Biometra TGRADIENT梯度PCR仪，MS1 Minishkaer IKA 涡旋混合器，LightCycler 1.5 ROCHE荧光定量PCR仪；宝生物工程（大连）有限公司生产的AFP酶连试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 检测方法 分别在患者入院前、后1个月晨起空腹状态下抽取静脉血5 mL，迅速分离血清，血细胞备用，放置在-80 ℃环境内备测，在测定前将标本取出，自然复融后对血清中AFP-L3、AFP水平进行检测。采用人小扁豆素结合型甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）酶联免疫吸附测定试剂盒测定AFP、AFP-L3的含量，并计算AFP-L3占AFP总量的百分比，以AFP-L3大于15%作为AFP-L3异常升高标准。

1.3.2 荧光定量RT-PCR 用常规密度梯度离心法分离外周血有核细胞。总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，于紫外分光光度计上定量，用Primescript试剂盒反转录合成cDNA，取细胞总RNA，紫外分光光度计定量。引物及探针为上游引物：5'-GTAAACCCTGGTCTTGGCC-3'；下游引物：下游引物：5'-TCAGAGAATGCAGGAGGGAC-3'，扩增最终片段长282 bp；荧光 探 针：5'-TTCATATGCCAACAGGAGGCCATGC-3'。 内 参为GADPH，上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，产物为450 bp。第 1轮 PCR，反应体系为 50 μL。取 cDNA 5.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，第1轮PCR上、下游外引物各7.5 pmol，Taq DNA聚合酶2.0 U，加灭菌水至50 μL。反应参数：94 ℃5 min 预变性；94 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；30 个循环；72 ℃ 5 min延伸。第2轮PCR取第1轮PCR产物作模板，加入7.5 pmol上下游内引物，余反应体系及反应条件同前。同时进行内参GAPDH扩增。最后绘制荧光定量PCR标准曲线，根据标准曲线计算样品和内参的Ct值，两者相比即得相对量的表达。每次RT-PCR实验均以分泌AFP的肝癌细胞系HepG2为阳性对照，阴性对照则以水取代cDNA。

1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前不同肿瘤指标的检测结果 AFP-L3联合AFPmRNA检测阳性率为64.3%，明显高于AFP、AFP-mRNA单独检测的阳性率（50.9%、40.2%），差异均有统计学意义（P<0.05）；与AFP-L3单独检测阳性率相比，虽联合检测阳性率升高，但差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 术前不同肿瘤指标的检测结果 例（%）

2.2 AFP-L3、AFPmRNA术后单独检测与联合检测阳性患者生存率 术前、术后联合检测AFP-L3和AFPmRNA均阳性的患者术后3年生存率较低。见图1、图2。

3 讨论

AFP是临床诊断肝细胞癌的肿瘤标志物已经使用较长时间，然而其特异性及敏感性较低[2-3]，临床诊断仍然存在较大的误诊漏诊率，新的符合需要的标志物又尚未发现，为了提高对肝癌诊断，联合检测肿瘤标志物就成为新的思路。

1970年，有学者首次采用淀粉凝胶电泳方法将AFP异质体由人体内分离[4]，AFP-L3则是肝癌细胞特异合成，与学AFP的浓度并无直接明显关系，随着临床研究的不断深入发现，在HCC的临床诊断、判定治疗效果及预测复发方面均有显著效果，且相较AFP具有更高的敏感性。

图1 术后AFP-L3阳性与AFA-L3、AFPmRNA联合检测阳性患者生

图2 术后AFPmRNA阳性与AFP-L3、AFPmRNA联合检测阳性患者生存曲线比较

AFP-L3作为AFP的异质体提高了肝癌诊断的特异性和敏感性，但它不能直接证实肝癌发生转移。1994年Matsumua等[2]首先运用巢式RT-PCR法检测出AFP mRNA存在于肝外转移的HCC患者外周血中，AFPmRNA是否能作为HCC复发转移标志物的研究成为热点。正常人体的训循环细胞中未出现AFPmRNA表达，而脱落进入血循环的正常肝细胞则失去了对AFPmRNA的表达能力，当肿瘤细胞破碎后，需将中大量的RNA酶会将mRNA迅速讲解，本次研究中，笔者检测出的AFPmRNA即是从癌变病灶脱落入血的完整肝癌细胞，因此可作为肝癌细胞血液播散标志，提示即使临床上未见有转移灶，但外周血中已存在循环的癌细胞，继而易发生肿瘤转移[5-6]。虽然有一部分学者的研究并不支持这种观点[7-8]，但从理论上看及大部分的研究认为，AFPmRNA作为肝癌细胞血液播散标志物是可行的。

通过手术治疗能够有效抑制肝癌病情，促进患者康复，术前患者血循环内可能已经存在少量的癌细胞，当机体免疫功能受到破坏时，血内癌细胞繁殖并扩散，导致肝癌术后存在较高的复发率，因此在临床检测中，通过观察血液循环中是否出现癌细胞，动态观察癌细胞变化，能够有效的指导临床治疗及对预后状况进行判断评估[9-11]。

本次研究结果显示，AFPmRNA联合AFP-L3检测阳性率为64.3%，相较AFP（59.8%）、AFP-mRNA（40.2%）单独检测阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05）；与AFPL3单独检测阳性率相较，虽联合检测阳性率明显升高，但差异无统计学意义（P>0.05），可能是笔者试验收纳的样本量过小所致，需以后作大批量试验进一步研究。术后联合检测AFP-L3和AFPmRNA的水平与肝癌预后有关，两者皆为阳性的病例复发率较高；3年生存率下降，两者皆阳性者的生存率（32.7%）与单独阳性者得生存率（49.2%）比较差异有统计学意义（P<0.05），提示AFPmRNA，AFP-L3对诊断肝细胞癌的残留复发更加敏感。由于外周血AFPmRNA水平与血AFP浓度之间并无明确直接关联，因此在HCC的诊断中具有较高的灵敏性及特异性，阳性检出率较高，两者之间可进行互补，同时可对AFP浓度无法准确反映HCC是否出现转移的缺陷进行弥补，从而为预后做出评估，还可早期诊断HCC，尤其对AFP阴性肝癌的诊断具有重要的临床应用价值。

本研究表明，AFP-L3联合AFPmRNA检测能够及时准确诊断HCC，同时可对治疗效果判断及复发进行预测，能够为临床治疗方案的制定进行科学指导，具有显著临床意义。

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