越南安息香种子脂肪酸的在线甲基化-GC分析研究

傅宇飞，孙 杨，潘再法，王丽丽

(浙江工业大学 化学工程与材料学院，浙江 杭州 310014)

越南安息香(Styraxtonkinesis)，又名白花树，东京野茉莉。属安息香科安息香属乔木树种，主要分布于热带、亚热带海拔100～2 700 m的低山丘陵区。其药用部分为安息香树脂[1]，其果实产量和产油率高，单株年产果实可达40 kg，可作为发展生物柴油专用油料树种[2]，其种子含有丰富的营养物质如脂肪油酯、矿物质元素，维生素等[3]。越南安息香种子能否成为一种新型食用油资源引起广泛关注。有文献报道采用索式提取和衍生化等前处理方法，继而进行气相色谱法测定果实中的脂肪酸[4]，但该方法前处理过程繁琐费时，使用大量有机溶剂和较大量的样品, 因此需要开发一种快速、简便、准确的分析方法。在线甲基化-气相色谱法(on-line methylation-gas chromatography) 是近年来迅速发展的一种快速分析有机酸、酯类等物质的方法[5]。采用该法并以稀释的四甲基氢氧化铵(TMAH)为衍生化试剂测定植物油和动物油脂中的脂肪酸成分已见报道[6-7]。但越南安息香种子中含有较多不饱和脂肪酸，碱性太强的甲基衍生化试剂会使多不饱和双键发生异构化和降解[8]，因此对于越南安息香种子中脂肪酸的测定需要选择合适的衍生化试剂。

采用在线甲基化-气相色谱/质谱法研究越南安息香果实中的脂肪酸的组成，对影响测定的主要因素如甲基化试剂、衍生化温度、色谱柱等进行优化，旨在建立越南安息香果实脂肪酸的测定方法。分别测定其种子油，种仁、种壳等的脂肪酸成分，并采用主成分分析进行数字化表征。比较安息香果仁与食用油的脂肪酸组成，以期为更好的开发越南安息香资源提供参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Thermo气相色谱仪, Thermo Trace DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪(美国，Thermo Fisher公司);Py-3030iD双击式纵型微型炉裂解器(日本，Frontier Lab公司)。

三甲基氢氧化硫(TMSH，0.2 mol/L甲醇溶液，日本东京化成工业株式会社)；四甲基氢氧化铵 (TMAH，25%甲醇溶液，Aldrich Chemical Company)；甲醇(分析纯，衢州巨化试剂公司)；4组越南安息香种子：产地分别为浙江泰顺、福建南平、福建永安、江西吉水，种子油样品由产地为浙江的安息香榨取，安息香样品均由浙江林科院提供；食用油：大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油、金龙鱼一代调和油均购于超市。

1.2 样品制备

液体样品制备：用分析天平称取越南安息香种子油及各种食用油样品各5.00 mg，甲醇定容至 1.00 mL。

图1 在线甲基化-GC(/MS)分析装置示意图

固体样品制备：将越南安息香种子碾碎，混合均匀后取约0.3 mg安息香果仁和果壳进样。

1.3 实验步骤

取上述样品液体1 μL 或约0.3 mg固体加入到样品杯，加入2 μL 0.2 mol/L衍生化试剂，将样品杯固定在进样杆上，装入裂解器，待仪器稳定后，按下进样杆使样品杯自由落到预先设定温度的炉心，样品受热后瞬间发生甲基化反应，生成的产物立即由载气带入气相色谱仪进行测定。装置见图1。

1.4 色谱条件

气相色谱：DB-23色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温：初温50 ℃，以10 ℃/min速率升到 240 ℃，保持10 min。汽化室和检测器温度均为240 ℃，分流比30 ∶1，载气N2，柱流量1 mL/min。

裂解器：裂解炉温度350 ℃，色谱进样口温度300 ℃。

质谱：传输线温度：280 ℃，电子轰击离子源(EI)，离子源温度：280 ℃，质谱扫描范围40～650 amu，采用NIST谱库进行比对分析。

1.5 定性和定量

采用标准品对照和质谱解析方法定性。采用峰面积归一化法定量。

2 结果与讨论

2.1 衍生化试剂及温度等条件的优化

不同的衍生化试剂对脂肪酸的甲基衍生化的影响至关重要。脂肪酸甘油酯与衍生化试剂在高温辅助下发生甲基衍生化反应，生成相应的脂肪酸甲酯，其原理见图2。有文献报道采用碱性较弱的三甲基氢氧化硫(TMSH)作为衍生化试剂能一定程度上减少多不饱和脂肪酸的异构化现象[9]。图3为采用TMSH和四甲基氢氧化铵(TMAH)两种衍生化试剂共存下得到的安息香种子油的气相色谱图。比较图3a与图3b可知，饱和的硬脂酸甲酯(C18 ∶0)和单不饱和的油酸甲酯 (C18 ∶1)峰强度无明显差异。在TMAH存在下(见图3b)多不饱和的亚油酸甲酯(C18 ∶2)与亚麻酸甲酯(C18 ∶3)峰强度很弱，而有TMSH存在下(见图3a)两者的峰强度相对要强的多。结果表明采用TMSH使异构化现象降低，检测灵敏度较高。因此，选择TMSH为甲基化试剂。

图2 脂肪酸甘油三酯在TMSH共存下的在线甲基衍生化反应示意图

a.添加TMSH with TMSH;b.添加TMAH with TMAH

裂解炉温度对反应的影响亦很重要：温度过低，衍生化反应不完全；温度过高，少量脂肪酸甘油酯易分解损失。分别考察了250、 300、 350和 400 ℃对硬脂酸(C18 ∶0)、油酸(C18 ∶1)和亚油酸(C18 ∶2)的甲基衍生化效果的影响，发现250 ℃时，由于低温衍生化不完全， 3种脂肪酸的甲基衍生化物的色谱峰强度较低；随着温度的升高，峰强度逐渐增强，当温度到达 350 ℃时，衍生化物色谱峰强度达到最大，并且在 350 ℃到 400 ℃基本不变。因此，在以下实验中选择裂解器温度为 350 ℃。

并考察了UA-5与DB-23色谱柱的分离效果，结果表明，在DB-23柱上，各脂肪酸成分得到很好的分离，出峰顺序为C16 ∶0、C18 ∶0、C18 ∶1、C18 ∶2与C18 ∶3，易于定性。

为考察方法的重现性，在以上优化条件下，取安息香种仁样品平行测定5次。结果表明，各脂肪酸峰面积的的质量分数相对标准偏差(RSD)小于3.81%，表明方法的重现性良好，适合安息香种子中脂肪酸的定量分析。

2.2 样品的在线甲基化-气相色谱(/质谱)分析

图4 安息香种子油(a)、种子果肉(b)和果壳(c)的在线甲基化-GC图

按实验1.2节与1.3节，对压榨得到的安息香种子油、安息香种子果肉和果壳进行了测定。图4是安息香种子油(a)、种子果肉(b)和果壳(c)的在线甲基化-气相色谱图。比较图4可见，种子油和种子果肉的色谱图基本相似，主要为脂肪酸种类和含量都比较接近。而果壳与种子油的色谱图则差别较大，从果壳中共鉴定出包括脂肪酸在内的20余种化合物。其中含量较高的1到5号峰成分分别为邻甲氧基苯酚、 3-羟基- 4-甲氧基甲苯、 4-乙基- 2-甲氧基苯酚、 2-羟基- 5-甲基苯乙酮和乙酸异丁香酚酯。其中邻甲氧基苯酚和乙酸异丁香酚酯具有一定刺激性。但这部分物质并未在图4(a)压榨种子油中观察到，说明压榨后经过滤净化等工艺处理步骤，这些物质已经基本被去除。

采用面积归一化法定量，得出越南安息香果壳、果肉和油中各种脂肪酸的GC含量，其脂肪酸组成见表1。表1表明饱和脂肪酸主要有棕榈酸(C16 ∶0)、硬脂酸(C18 ∶0)，不饱和脂肪酸主要有油酸(C18 ∶1)、亚油酸(C18 ∶2)和亚麻酸(C18 ∶3)等。不饱和脂肪酸总含量在安息香种子油、果肉及果壳中分别在81%～87%。亚麻酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸含量接近50%，其中以亚油酸含量最高，达43.2%～47.3%。测得的脂肪酸组成与文献报道[4]基本一致，说明该方法可行。油脂中的不饱和脂肪酸以及人体必需的亚油酸是评价油脂营养的两个重要指标，以上结果表明安息香种子油脂具有较高的营养价值，有可能发展成为食用油脂的来源之一。

表1 越南安息香的脂肪酸组分及含量比较

2.3 样品的主成分分析

为了考察不同产地的安息香种仁中脂肪酸组成是否相同，以及安息香油与食用油的脂肪酸组成是否接近，采用所建立的方法对4种不同产地的安息香种仁、6种食用油样品进行了测定。以8个脂肪酸组分作为考察对象，采用归一化法定量, 结果见表2。由表2可知，4组不同产地的安息香种仁脂肪酸组成相似，说明产地对其脂肪酸组成影响不大。除花生油外，安息香油与其他植物油相同均是C18 ∶2含量最高，其次是C18 ∶1和C16 ∶0。由表2可知越南安息香的多不饱和脂肪酸亚油酸(C18 ∶2)和亚麻酸(C18 ∶3)的相对含量与大豆油和葵花籽油相近，高于其他食用油。C18 ∶2和C18 ∶3必须由食物中摄取，而不能由机体自行合成，故而被称为必需脂肪酸，具有调节人体血压，促进新陈代谢，延缓细胞老化等功效。

为更直观地比较10个油脂样品，采用SPSS软件对表2的结果进行相似性分析[10-12]。由相似矩阵可知，4个安息香种仁样品之间的相关系数达到0.999以上，说明尽管产地不同，但分布在浙江、福建和江西的安息香样品脂肪酸组成非常相近，与6种植物食用油的相关系数在0.963～0.991，表明安息香油的组成与食用油相似，且与玉米油最为相似，相关系数在0.987～0.990。

该方法简便快速，无需前处理，定量准确，重现性良好。与传统索式提取法等测定脂肪酸相比，大大缩短了检测时间，且由于样品用量少，可直接固体进样分析，使对安息香种子中的果仁和果壳的组成分析成为可能。但在果壳测定中观察到的10余种物质是否在提油工艺中已经完全去除，及对安息香油作为食用油的安全是否构成影响还有待进一步研究。以上研究可为越南安息香种子油的综合利用提供参考。

3 结 论

3.1 建立了测定越南安息香种仁、种壳及种子油中脂肪酸组成的在线甲基化-气相色谱(/质谱)法。越南安息香种子油中主要脂肪酸为棕榈酸(C16 ∶0)、硬脂酸(C18 ∶0)，油酸(C18 ∶1)、亚油酸(C18 ∶2)和亚麻酸(C18 ∶3)，不饱和脂肪酸含量在84.5%以上，其中亚油酸含量最高，达47.29%，表明安息香种子油脂有可能成为食用油脂的来源之一。

3.2 越南安息香种子油中人体必需的多不饱和脂肪酸含量(C18 ∶2和C18 ∶3)与大豆油和葵花籽油相近，高于一般植物油，具有较高的营养价值。

3.3 对4种不同产地的越南安息香种仁与6种食用油的脂肪酸组成进行了分析，相似性分析的结果表明：不同产地的安息香种仁的脂肪酸组成相似，其脂肪酸组成与食用植物油相近，且与玉米油的组成分布最为接近，相关系数在0.987～0.990。

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