毛细管区带电泳测定两种生物碱与牛血清白蛋白的结合常数研究

霍鹏，朱平川，徐远金

（1.桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林541004；2.广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，广西 南宁530004）

0 引言

盐酸麻黄碱、磷酸可待因是毒品和药物中常见的生物碱，其结构式见图1.研究表明，这些生物碱具有多种生理活性和药理疗效，如镇静、镇痛、镇咳、抑制肠胃蠕动及抑制呼吸等，还具有一定的毒性和麻醉性，连续服用易产生习惯成瘾问题，严重可导致用药者精神崩溃，做出极端行为.近年来，吸毒和药物滥用对人们的生活和社会安定构成了极大威胁，成为备受关注的社会问题，因而对这些药物的管理很重要［1］.血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，可以同许多内源和外源性化合物结合，从而成为药物小分子—蛋白质结合研究的主要蛋白质.当药物自给药部位吸收进入血液循环后，要通过血浆的贮存和运输到达受体部位才能产生药理作用，因此研究盐酸麻黄碱、磷酸可待因与牛血清白蛋白的相互作用对其在体内的分布、清除、活性、毒性等有重要的影响，对于阐明药物的作用机制、药代动力学及药物的毒副作用具有重要意义.

研究药物与蛋白相互作用常用的方法主要有：紫外可见分光光度法［2］，傅立叶变换红外光谱法［3］，荧光光谱法［4-5］，圆二色 谱 法［6］，毛 细 管 电 泳 技 术［7-9］，平衡透 析技 术［10-11］，电 化 学 技 术［12-13］，核磁共振技术［14-15］.CE作为一种新型分离技术，用于分子间相互作用的研究具有以下优点：分析速度快，分离效率高，样品用量少（nmol级），对受体的纯度要求不高，可在溶液中进行，可保持生物分子相互作用所需要的生理条件，更接近体内的结合行为，有多种模式可供选择，适用于各种亲和体系等［16］.但蛋白质大分子易被毛细管管壁吸附，使背景吸收信号增强、电渗流发生变化、电泳峰展宽、这都会在一定程度上影响测定结果［17］.本文中采用毛细管区带电泳，通过测定在不同浓度BSA的缓冲溶液条件下化合物迁移时间的变化，研究盐酸麻黄碱，磷酸可待因两种生物碱与BSA的相互作用，并计算其结合常数.

图1 两种生物碱的结构图

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 P／ACETMMDQ毛细管电泳仪带二极管阵列检测器（美国Beckman公司）；未涂层弹性石英毛细管（75μm×60cm，有效长度50cm）（河北永年锐沣色谱器件有限公司）；UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；Orion 720A型酸度计／离子计（美国Thermo公司）；Synthesis A10TM超纯水系统（美国Millipore公司）；ME 215S电子天平（德国Sartorius公司）.

盐酸麻黄碱、磷酸可待因（购自中国药品生物制品检定所）；牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma公司）；其它试剂均为分析纯.

1.2 样品溶液的配制

1.2.1 盐酸麻黄碱、磷酸可待因溶液的配制 取盐酸麻黄碱、磷酸可待因对照品各约10mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，用缓冲溶液溶解并定容，配成1.00mg／mL的对照品储备液，经0.45μm滤膜过滤，密封于4℃下冰箱中保存，实验时用缓冲溶液稀释至所需浓度.

1.2.2 牛血清白蛋白溶液的配制 称取适量的BSA用电泳缓冲溶液配制成0.5mmol／L溶液，然后依次稀释到0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035mmol／L的工作溶液，经0.45μm 滤膜过滤，密封于4℃下冰箱中保存备用.

1.2.3 电泳条件 以25mmol／LTris-HCl（pH＝7.40）为电泳缓冲溶液，未涂层弹性石英毛细管（75 μm×60cm）为分离通道，压力进样（3.447 5kPa×6sec），分离电压20kV，柱温37℃，检测波长214 nm.缓冲溶液与样品均用0.45μm滤膜过滤，并超声脱气.毛细管每天使用前，分别用0.1mol／L NaOH、超纯水和缓冲溶液各冲洗10min.

2 结果与讨论

2.1 电泳分离条件的优化

2.1.1 缓冲体系的选择 体外实验模拟人体环境最常用的缓冲体系有：Tris-HCl缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液，人体内的环境是一个pH相对稳定的缓冲体系，血液及组织液的正常pH约为7.40.因此，实验考察了pH 7.40条件下Tris-HCl缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液对两种组分分离的影响.结果表明：在磷酸盐缓冲体系中，磷酸可待因灵敏度低，峰形不好；在Tris-HCl体系中，盐酸麻黄碱和磷酸可待因可以获得较好的分离，并且灵敏度高.因此选择Tris-HCl体系为运行缓冲溶液.

2.1.2 缓冲溶液浓度的影响 实验考察了Tris-HCl缓冲溶液浓度在15～35mmol／L范围内对分离的影响，浓度较小时，两组分峰很宽，迁移时间短；随着浓度的增大，分离度增大，灵敏度增高，迁移时间增加，而浓度过高时，组分峰迁移时间较长，基线噪音增加.当Tris-HCl浓度为25mmol／L时，两物质间分离度和灵敏度达最好，迁移时间也相对较短，本实验选定Tris-HCl缓冲溶液的最佳浓度为25mmol／L.

2.1.3 柱温、分离电压和进样时间的影响 为了近似模拟生理条件，选择模拟人体体温37℃，因此选择柱温为37℃，在此条件下，考察了15～30kV范围内分离电压对实验结果的影响.随着分离电压的升高，电渗流速度加快，组分的分析时间明显缩短，峰形尖锐.当分离电压达到20kV时，两种组分在5 min内可获得很好的基线分离.因此，选择分离电压为20kV.

固定3.447 5kPa的压力进样，在6～12s范围内改变进样时间.实验表明进样时间越长，灵敏度越高，但随着进样量的增大，溶质区带加宽，分离度下降，选择进样时间为6s.

2.2 盐酸麻黄碱、磷酸可待因与BSA的相互作用

2.2.1 定性分析 在25℃下，用紫外分光光度法考查盐酸麻黄碱、磷酸可待因分别与BSA混合物（V∶V＝1∶1）的吸光度值，随着蛋白质与药物的结合，混合物的吸收值降低，图2为0.1mmol／L盐酸麻黄碱、磷酸可待因与0.1mmol／L BSA混合后的紫外光谱图.在波长278nm处，未检测到盐酸麻黄碱和磷酸可待因的吸收峰，随着盐酸麻黄碱和磷酸可待因的加入，BSA的吸收峰下降，说明了牛血清白蛋白与两种药物均存在相互作用.

图2 0.1mmol／L BSA （a）、0.1mmol／L磷酸可待因与0.1mmol／L BSA （b）、0.1mmol／L盐酸麻黄碱与0.1mmol／L BSA（c）混合后的紫外光谱

2.2.2 定量分析 采用毛细管电泳淌度移动法测定两种生物碱类药物小分子与BSA的结合常数，将BSA（P）加入到缓冲溶液中，将生物碱类药物小分子（M）作为样品，按优化后的电泳条件进行检测，二者发生结合反应，形成结合物（MP），根据溶液中电泳淌度的变化，假设结合比为1∶1，即：

其中Kb为药物与蛋白质的结合常数，［M］和［P］分别为平衡体系中游离化合物M和游离蛋白质P的浓度，［MP］为化合物与蛋白质结合得到的复合物的浓度.

依据色谱原理可推导出：

式中，φ为相比（Vs／Vm），s和m分别代表固相和液相，［M］s表示与BSA结合的药物小分子的浓度，［M］mo为当缓冲溶液中无BSA存在时药物小分子的原始浓度.容量因子k可表示为：

（式中tr表示缓冲溶液中添加BSA后药物的迁移时间；tion表示缓冲溶液中无BSA存在时药物的迁移时间；tmc表示BSA的迁移时间）

根据方程（3）作k-［P］线性回归图，得到直线的斜率和截距，计算结合常数Kb，结果见表1.

实验表明，两种药物小分子与BSA均发生了一定程度的相互作用.由表1可以看出，所得到的两条回归直线的线性相关系数均大于0.9，说明本实验所作的化合物与BSA的结合摩尔比为1∶1以及化合物的保留行为与色谱方法中相似的假设是合理的.化合物与BSA的结合常数均在104L／mol数量级，说明药物与蛋白质分子之间存在着较强的相互作用.

表1 两种生物碱与BSA相互作用的结合常数

图3所示为两种生物碱类药物小分子在不同浓度BSA电泳缓冲溶液中的毛细管电泳谱图，由图可看出，随着BSA的浓度由0mmol／L增加至0.035mmol／L，药物小分子的保留时间逐渐增大，二者之间的分离情况也得到了明显的改善，主要是因为随着BSA浓度的增大，电泳缓冲溶液的粘度以及和毛细管壁的作用发生了变化，在电泳谱图上表现为出峰延后，并且随蛋白含量的进一步增大，相互作用逐渐增强，峰形也会相应出现变矮，展宽严重的趋势，出现这种现象的主要原因是由于结合作用生成了结合物，而结合物和游离药物的电荷数不同，离子半径相差较大，从而使二者的电泳淌度不一致.

图3 盐酸麻黄碱和磷酸可待因的毛细管电泳图

3 结论

本文中利用毛细管区带电泳法，通过两种生物碱在不同浓度下的BSA迁移行为的变化，计算得到其与BSA的结合常数均为104L／mol数量级，这对药物与白蛋白的结合规律和机理的进一步探讨具有重要意义.该方法简便、快速，具有较好的准确性和重现性，在研究小分子与生物大分子的弱相互作用方面具有广阔的应用前景.

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