蛇床子总香豆素的杀螺活性研究

吴明煜，柯文山，刘旭，黄丽陶，王万贤，郭晓红

（1.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉430062；2.武汉生物工程学院生物科学与技术系，湖北 武汉430415）

0 引言

作为日本血吸虫（Schistosomajaponicun）的唯一中间寄主，钉螺（Oncomelaniahupensis）是血吸虫病传播唯一和最脆弱的一环，灭螺能有效地降低血吸虫病（schistosomiasis）的传播［1］.随着全球气候变暖，流行区人流物流急剧增加，血防工作仍旧面临严峻的形势［2-3］.已发现多种植物能毒杀钉螺，其中的有效成分分属萜类化合物、皂苷类、鞣质、生物碱类、（异）黄酮类、呋喃、萘醌、香豆素等［4-6］.蛇床子为伞形科植物蛇床（Cnidiummonnieri（L.）Cuss.）的果实［7］.蛇床子不仅在临床上有止咳、镇痛、抗菌等功效，也具杀虫作用［7-9］.本研究分离获得蛇床子总香豆素，用其水溶液进行杀螺实验，同时比较不同浓度总香豆素对钉螺体内酯酶同工酶及糖原含量的影响，以揭示蛇床子总香豆素的杀螺机理.

1 材料和方法

1.1 实验材料 钉螺采自湖南省洞庭湖区，选取成螺为7～8旋，逸幼法去掉阳性螺［10］，喂养在无氯清水中.实验用蛇床子生药材购自武汉市神草中药饮品有限责任公司.

1.2 蛇床子总香豆素的提取 将蛇床子生药材除尘去杂后置烘箱内50℃烘干至衡重，机械粉碎成粗粉.称取蛇床子粗粉1 000g，用8倍量丙酮室温下浸提3次，每次3d.合并滤液，减压浓缩至无丙酮，得深绿色稠状物，用5倍量石油醚稀释，静置24h.将不溶性粘稠物用石油醚多次热溶解，冷冻析晶；石油醚溶液蒸馏去除石油醚，得深绿色稠状物，加入1倍量NaOH（2mol／L），10倍水稀释，静置析晶［11］.合并两部分结晶即得蛇床子总香豆素（TCFC）16g.

1.3 蛇床子总香豆素浸杀实验 先取适量蛇床子总香豆素1mL乙醇溶解，然后按照等比稀释法以无氯水分别配制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg／L共6个不同浓度梯度的处理药液各1 000 mL.4袋钉螺（每袋15只）分别投入每个含处理药液的玻璃缸中.处理24、48、72、96h后，每缸中钉螺随机取出1袋，无氯清水冲洗后，观察死活.24h内开靥爬行即为活螺，余下者用触刺或解剖方法鉴别死活.另在1 000mL无氯水中滴加1mL无水乙醇作为对照.所有的处理均设定3次重复，在（25±1）℃下进行，并统计不同处理下的钉螺死亡率.

1.4 酯酶同工酶电泳分析夹竹桃强心总甙对钉螺软体组织质量的影响 按照LC50配置蛇床子总香豆素药液.并投入4袋钉螺，每袋20只.钉螺处理1、2、3、4d后，随机选一袋，取出活螺，并用无氯清水漂洗3～4h后，吸干水分后，敲碎螺壳，取出钉螺的肝脏部分，加3滴磷酸缓冲液冰浴匀浆，匀浆液0℃下（10 000r／min，20min）离心.电泳样品包括取上清液、0.3mL 40%蔗糖以及0.1%的溴酚蓝2滴.对照组为正常饲养螺.聚丙烯酰胺垂直板进行电泳［12-13］.

1.5 蛇床子总香豆素对钉螺软体组织质量和钉螺糖原的影响 按照LC50配置蛇床子总香豆素药液.每组成螺30只（大小相当），分别浸杀1、2、3、4d后用无氯清水漂洗，吸干水分后敲碎螺壳，取出整个软体组织，称量湿重，烘箱常温吹干，称量干重后磨粉.每次取样（干粉）15mg，糖原制备按文献［14］进行.糖原含量测定采用蒽酮显色法［14］.配置葡萄糖标准溶液作标准曲线.721分光光度计在620nm处测定糖原制备液吸光值，并依据标准曲线换算糖原浓度.实验重复3次，平均值作为实验结果.

1.6 数据处理分析 采用SPSS软件进行双因素方差分析（two-factors analysis of variance），显著水平α＝0.05.

2 结果

2.1 蛇床子总香豆素杀螺活性 蛇床子总香豆素水溶液浓度以及处理时间都极显著地提高了钉螺死亡率（P＜0.01），且药液浓度与处理时间对钉螺死亡率的影响存在极显著的交互效应（P＜0.01）.钉螺浸杀96h的结果（图1）显示：1.25mg／L和2.50mg／L两个浓度在72h都达到了过半的致死率（66.67%和77.78%）；10mg／L以上的蛇床子总香豆素药液具有100%的明显毒杀钉螺致死效果.对试验数据进行概率单位回归分析，48h、72h、96h的LC50分别为4.64、0.50、0.31mg／L，相应的95%置信区间为3.58～5.88、0.10～1.02、0.03～0.72mg／L.LC90为27.49、8.24、3.12mg／L，其相对应的95%置信区间为19.14～46.80、5.29～17.09、1.88～5.26mg／L.

图1 蛇床子总香豆素药液杀螺效果

图2 酯酶同工酶图谱

2.2 酯酶同工酶电泳结果分析 酯酶同工酶电泳图谱结果见图2.整个图谱可发现9条深浅不一的酶带.随着处理时间的延长，各个酶带呈现明显宽度和颜色的变化，并伴随酶带条数的减少.在处理24h和48h时，酶带颜色加深，并伴随新酶带的出现，表明此时酯酶活性高于对照组；处理时间在72h以后，各酶带颜色明显变浅，分别有2条（72h）和4条（96h）酶带消失.

2.3 钉螺软体组织干重和糖原结果与分析 蛇床子总香豆素和处理时间都显著地影响了钉螺的干重和糖原含量（P＜0.05）.经蛇床子总香豆素（浓度为LC50）处理钉螺4d后的钉螺的软体组织的平均干重、糖原含量发生明显变化（表1）.总香豆素和处理时间与钉螺的干重显著地负相关，随着处理时间的延长，钉螺的干重明显降低，并在第3、4天都达到显著水平（P＜0.05）.钉螺经提取物处理后糖原含量的变化如表1所示.表中数据表明，经蛇床子总香豆素处理1d后，相对于清水对照组数据，钉螺软体的糖原含量开始逐渐下降，减少幅度从7.66%到30.06%，并在第3、4天都达到显著水平（P＜0.05）.

表1 钉螺的软体组织干重和糖原含量

3 讨论

由于化学杀螺剂对环境的污染，生物源杀螺剂的研究日益受到重视［15］，本研究结果表明，蛇床子总香豆素确有较强的杀螺作用.10mg／L以上的蛇床子总香豆素药液处理3d以上时间，具有100%的杀螺效果.作为植物源类药物，蛇床子总香豆素对周围环境污染远小于化学杀螺剂.酯酶作为动物体内的一种重要解毒酶系统，参与蛋白质代谢、酯类代谢、信号传导和解毒等多种过程，并广泛分布于动物各细胞内［16-17］.本研究发现在蛇床子香豆素处理后，钉螺酯酶活性均表现出先增强，然后逐渐减弱和消失的趋势.本结果和其他植物源药物（百部总碱、夹竹桃强心总甙和羊蹄）的杀螺研究一致［12-13，18］.在药物处理钉螺的早期，酯酶表达水平受药物刺激而增加，钉螺的解毒能力增强；随处理时间的延长，药物在钉螺体内的浓度升高，当超过钉螺耐受浓度的生理阀值后，钉螺酯酶表达被抑制，最终降低钉螺的解毒能力，致使钉螺死亡［13］.作为钉螺体内重要能源贮存形式，糖原在钉螺体内广泛分布，并分解为葡萄糖，提供生理活动所需能量.当糖原浓度降低时，钉螺的解毒活性会受到抑制.蛇床子总香豆素能显著地降低钉螺体内的糖原含量，至96h时减少幅度达30.06%.这与其他植物源药物的杀螺报道一致［19］.杀螺药物可能通过破坏钉螺的肝功能，改变糖原代谢过程中的某些酶的活性，抑制消化道摄取葡萄糖能力等方式，导致糖原含量的下降［12］.

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