UPLC－MS／MS法同时测定川黄口服液中的5种有效成分

岑卫健，朱平川，范晓苏，莫琪红

（1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室（广西大学），广西 南宁530004；

2.广西大学化学化工学院，广西 南宁530004；3.广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁530004）

0 引言

川黄口服液是由丹参、制何首乌、党参、黄芪、枸杞子、杜仲、当归、川芎、蛤蚧、蕲蛇、海龙12味中药材研制而成的复方口服液，具有益气养血、滋补肝肾，活血化瘀.能改善气血两虚，肝肾不足所致的神疲乏力，头晕目眩，腰膝酸软等症.对免疫功能低下、放化疗后白细胞减少及高脂血症等有辅助治疗作用［1］.已有文献报道采用毛细管电泳法［2］、高效液相色谱法［3-5］、反相液相色谱法［6］测定香丹注射液中原儿茶醛，丹参中原儿茶醛，当归补血汤中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ，活血安痛酒中隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量.在川黄口服液原质量标准中，只有性状鉴别检查和正丁醇、原儿茶醛的定量检查方法，目前尚少见有文献报道对川黄口服液中其他有效成分的测定.

利用超高效液相色谱-串联质谱检测法（UPLC-MS／MS），可以较好地分离分析中药口服液中的复杂成分［7-8］.本文中运用UPLC-MS／MS建立了同时测定益气养血口服液中的原儿茶醛、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 5种有效成分含量的分析方法，该方法具有简单、快速、准确、高灵敏度等优点，可以用于实际的样品分析，为药物质量控制提供依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱-三重四极杆质谱系统6460（美国Agilent公司），数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电子天平（德国Sartorius），超纯水仪（美国Millipore公司）.原儿茶醛对照品（批号：中国药品生物制品检定所），黄芪甲苷对照品（批号：中国药品生物制品检定所），黄芪皂苷Ⅱ对照品（批号：中国药品生物制品检定所），隐丹参酮对照品（批号：中国药品生物制品检定所），丹参酮ⅡA对照品（批号：中国药品生物制品检定所），甲醇、乙腈（色谱纯，Themro Fisher公司），甲酸（分析纯，广东光华化学厂有限公司），水（超纯水，实验室自制）.川黄口服液（批号分别为：1207308、1209183、1301242，四川升和药业股份有限公司）

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的配制 准确称取5种对照品各10.0mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔过滤膜过滤，对照品储备液的质量浓度为1.00g／L，在4℃下保存备用，使用前用甲醇稀释到所需的浓度.

1.2.2 供试品溶液的配制 准确量取益气养血口服液5mL，置于5mL的EP管中，于12 000r／min下离心10min，将上清液置于另一5mL的EP管中，经0.22μm的微孔过滤膜过滤备用.

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（50mm×2.1mm，1.8μm），流动相：A相为乙腈溶液，B相为含0.1%甲酸的水溶液；流速：0.35mL／min；进样量：1μL；梯度洗脱程序：0～5min，90%～80%B；5～6min，80%～60%B；6～16min，60%～30%B；16～20mim，30%～0%B；20～24mim，0%～90%B.

1.2.4 质谱条件 采用电喷雾电离源（ESI）正离子和负离子模式，多重反应监测模式（MRM模式）.雾化气：氮气，压力是2.8×105Pa；鞘气：氮气，温度是360℃，流速是12L／min.干燥气：氮气，温度是350℃，流速是10L／min.毛细管的电压：4 000V，喷嘴电压：0V.5种目标组分的其他质谱分析参数见表1.

表1 5种成分的部分质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择 文中考察了乙腈-水和甲醇-水两种流动相体系，实验结果表明使用乙腈-水体系作为流动相5种成分分离良好且峰形对称，而使用甲醇-水作为流动相时，黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA4种物质的色谱峰主要集中在16～17min，无法得到有效分离.在此基础上，进一步比较5种物质在不同浓度甲酸水（0.1%，0.2%，0.3%）条件下的灵敏度，结果表明，0.1%甲酸水最有利于提高灵敏度.

2.2 质谱条件的选择 文中分别采用了正离子和负离子检测模式，结果显示，黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA，在负离子模式下检测不到，而在正离子模式下灵敏度较高，原儿茶醛在负离子模式下的灵敏度比在正离子模式下的灵敏度高.

2.3 线性关系考察 精密吸取5种对照品的储备液，甲醇溶液稀释，配制一系列不同质量浓度的对照品，混 合，在 “1.2.3”和“1.2.4”的实验条件下测定，重复3次.以被测组分质量浓度为横坐标，峰面积的平均值为纵坐标进行线性回归分析，具体数据见表2.

表2 5种组分的线性方程、相关系数及线性范围

2.4 精密度试验 同一批次待测样品，按“1.2.2”制备供试样品，在“1.2.3”和“1.2.4”的实验条件下连续进样分析6次，根据色谱峰面积计算相对标准偏差（RSD），结果见表3.结果显示，该方法有较良好的精密度.

化合物 精密度／% 稳定性／% 重复性／%0.93 0.83 0.88黄芪甲苷 0.68 0.86 1.2黄芪皂苷Ⅱ 0.81 0.56 0.69隐丹参酮 0.95 0.91 1.1丹参酮Ⅱ原儿茶醛A 0.79 0.54 0.47

2.5 稳定性试验 同一批次待测样品随机取6份，按“1.2.2”制备供试样品，在“1.2.3”和“1.2.4”的实验条件下测定，分别于0、2、4、8、12h进样测定，根据色谱峰面积计算相对标准偏差（RSD），结果表明供试样品在12h内稳定性良好，结果见表3.

2.6 重复性试验 同一批次待测样品随机取6份，按“1.2.2”条制备供试样品，在“1.2.3”和“1.2.4”条的实验条件下测定，根据色谱峰面积计算相对标准偏差（RSD），结果见表3.结果表明供试样品重复性良好.

2.7 加样回收率试验 分别精密量取已知这5种组分含量的同一批次川黄口服液各1mL，共9份，每组3份，加入高、中、低3个质量浓度的混合标准品.按“1.2.2”条制备供试样品，在“1.2.3”和“1.2.4”条的实验条件下连续测定6次，分别计算回收率，结果见表4.

表4 5种组分在样品中的加标回收率（n＝3）

续表4

2.8 样品含量测定 分别精密量取不同批号的样品，按“1.2.2”条方法制备供试样品，在“1.2.3”和“1.2.4”实验条件下连续测定6次.将各组分的峰面积代入回归方程，结果见表5，对照品及样品的分离情况见图1.

图1 对照品（A）和样品（B）的UPLC-MS／MS色谱图

3 结论

采用UPLC-MS／MS技术建立了同时测定川黄口服液中丹参酮ⅡA，隐丹参酮、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、原儿茶醛5种药效成分含量的分析方法.实验结果表明，该方法灵敏度好、定量能力强、准确度高、快速、简单.该方法的建立有利于进一步完善川黄口服液及其类方的质量控制及药代动力学、药物疗效等相关研究.

表5 样品含量结果 mg／L

［1］王保磊.川黄口服液治疗白细胞减少症19例［J］.中国医药指南，2010，4（8）：96.

［2］蔡梅，赵陆华，胡昌勤，等.高效毛细管电泳法测定香丹注射液中丹参素和原儿茶醛的含量［J］.中国药科大学学报，2001，32（2）：130-132.

［3］黄敬群，张秀巧，郭军，等.高效液相色谱法测定5种不同产地丹参中丹参素和原儿茶醛含量［J］.安徽中医学院学报，2005，24（1）：37-40.

［4］高建，夏泉，黄赵刚，等.HPLC-ELSD同时测定当归补血总苷中黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ［J］.中成药，2012，34（2）：268-272.

［5］黄开颜，戴冰，周新蓓.HPLC法测定活血安痛酒中隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量［J］.中国医药导报，2010，7（34）：42-46.

［6］靖会，杨黎彬，边军昌，等.RP-HPLC法测定丹参不同部位中丹参素和原儿茶醛的含量［J］.安徽医药，2011，15（6）：691-692.

［7］徐远金，许桂苹.高效液相色谱-质谱法测定性保健品中脱水吗啡、西地那非、前列地尔［J］.色谱，2005，23（6）：633-635.

［8］刘莹，韩深，冯骞.超高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱法测定中药中马兜铃酸A和B的含量［J］.色谱，2011，29（11）：1076-1081.