成骨因子BMP-2/Smads/Runx2信号转导通路

於绍龙，刘丹平

(1.辽宁医学院;2.辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)-2 是转化生长因(trans-forming growth factor，TGF)-β超家族的生长因子，为促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。在骨形成过程中，BMP-2 作为启动调节因子促进新骨形成，并且在出生后，BMP-2 也参与骨骼动态平衡的维持。骨组织生长、发育、代谢和衰老表现为骨量增加或减少，在组织学上则以骨生成和骨重建方式进行，表现为骨组织细胞分化、增殖、凋亡。其中涉及的多条信号通路中BMP-2/Smads/Runx2 信号通路对于骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞及骨细胞外基质合成、分泌显得尤为重要。

1 BMP-2 及其受体

BMPs 是TGF-β 超家族中的成员之一，为广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，目前已有20 余种成员，是较强的成骨因子［1］。其中BMP-2 是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一，其在体内以自分泌和旁分泌的形式诱导骨、软骨及骨相关结缔组织的形成［2］。

BMP-2 含有两种受体，分别为I 型受体(bone morphogenetic protein receptor I，BMPR-I)和II 型受体(bone morphogenetic protein receptor II，BMPR-II)［3］。两种受体是跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，在胞内区具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，该受体以二聚体行使功能。BMPR-I 为单次跨膜的糖蛋白受体，在BMPR-I 的胞浆区蛋白激酶结构N 段和细胞之间，存在一个富含丝氨酸(Serine，Ser)和甘氨酸(Glycine，Gly)的结构域，称为GS 结构域，有若干的磷酸化位点，GS 结构域中有一段保守的Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 序列，称为GS 序列，为BMPR-I 所特有，可以被BMPR-II 激酶磷酸化，从而使BMPR-I 型受体磷酸化，向胞内传递胞外信号［4］。BMPR-II 与BMPR-I结构类似，但与BMPR-I 的不同点为:分子量稍大;细胞膜外区较BMPR-I 长;无GS 结构域;具有不依赖配体的组成性激酶活性，但可以与BMP-2 结合［5］。BMP-2 与细胞表面BMPR-I 和BMPR-II 结合而激活，通过激活下游Smads 信号调节成骨基因转录而发挥其成骨作用。

2 Smads

Smads 蛋白家族是近年发现的细胞内信号传导蛋白，直接参与TGF-β 超家族成员的信号传导。目前发现9 个亚型，即Smad1～9。Smads 家族成员结构类似，由Mad 以及Sma 两个相关等位基因编码。基本结构主要由3 个结构域组成:保守氨基端(N 段)MH1 区，为Mad 类似物1，主要与DNA 结合，但在Smads 未激活之前，它也有抑制MH2转录激活的作用;羧基端(C 段)MH2 区，为Mad 类似物2，它参与Smads 与受体的结合以及Smads 之间的聚合体的形成，MH2 区也有抑制MH1 区与DNA 结合的作用;中央链接区，为富含脯氨酸的铰链区，可将MH2 区及MH1 区链接成一个完整的分子。该连接区内有多个磷酸化位点，被磷酸化激活后可以抑制Smads 蛋白的核转移，是Smads蛋白的负调控区域［6］。

根据结构以及在信号转导中的作用将Smads 蛋白分为3类:(1)受体调节型Smad (Receptor activated Smad，R-Smad)，包 括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9，其中Smad1、Smad5、Smad8 可调节BMP-2 信号转导。R-Smad 蛋白C 端功能域末端含有丝氨酸-丝氨酸-任意氨基酸-丝氨酸(Ser-Ser-X-Ser，SSXS)磷酸化位点，可与BMPR-I 直接作用并被磷酸化，磷酸化的R-Smad 与Co-Smad 形成复合物后可转移至细胞核内，调节靶基因对BMP-2 信号的表达;(2)共同介质型Smad(Common Smad，Co-Smad)，哺乳动物类只有Smad4，被磷酸化后与R-Smad 形成杂聚体，然后转运至细胞核调节靶基因的转录。它的C 端功能域没有磷酸化位点，不能与BMPR-1 相互作用，也不能被磷酸化，但它可以与Smad家族中的其它成员相互作用并形成稳定的异源三聚体。这种三聚体的形成是BMP-2 信号转导所必须，Smad4 缺陷的细胞不再对BMP-2 信号产生应答，而转染野生型Smad4可以重建其表达［7］;(3)抑制性Smad (Inhibitory Smad，I-Smad)，包括Smad6，Smad7，对信号通路发挥负调控作用。它们在结构上和其它的Smad 成员有很大的不同，C 端功能域缺乏磷酸化位点，没有保守的MH1 功能域，而只在MH2 功能域与其它的Smad 具有较大的同源性。I-Smad 与R-Smad 竞争性与BMPR-I 结合，干扰R-Smad 与BMPR-I 结合以及磷酸化，从而抑制信号转导，在BMP-2 信号通路中发挥负调控作用。经典的Smads 通路是R-Smads 激活后与Co-Smad 形成复合体，共同转移至细胞核内调节靶基因转录［8］。

3 Runx2

Runxs 是新发现的一类调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录因子，它们的分子结构中均含有一个由128个氨基酸组成的DNA 结合区，该结合区与果蝇属的分节基因Runt 同源，因此而被称为Runt 结构域。Runxs 包含三个亚型，Runx1、Runx2 和Runx3。Runx1 是红细胞形成所必需的蛋白，人类白血病中常见多种染色体易位于Runx1 基因，其突变可导致急性骨髓细胞性白血病。Runx3 则参与神经元形成、胸腺激素生成以及肿瘤抑制作用，它的突变与胃癌发生相关。Runx2 又称核结合因子(core-binding factor subunit alpha-1，Cbfα1)，为重要的成骨细胞分化转录因子。Runx2 参与调控成骨细胞分化进程中细胞外基质蛋白的基因表达，同时通过调节软骨、成骨细胞的分化完成对骨生成的控制，对成骨细胞的成熟、稳定起了重要的作用［9］。

Runx2 存存在3 个转录激活域(AD)、1 个抑制区域(RD)和1 个短的Myc 相关核定位信号(nuclear localization signal，NLS)。它的3 个激活结构域(AD1、AD2、AD3)中主要的激活结构域为AD3，AD1、AD2 的结构域使Runx2具有强大的转录能力，但是不能自主活化转录。Runx2 能通过C 末端区域与Smads 蛋白相互作用形成共调节子，激活或者阻遏表达。Runx2 的C 末端区域含有核基质定位信号(nuclear matrix targeting signal NMTS)可将Runx2 定位在核内区域调控骨特异性基因转录，此信号序列与Smads 相互作用的区域相互重叠，一旦此区域发生突变成骨细胞分化不能正常进行骨发育出现缺陷［10］。

Runx2 的表达受到参与成骨细胞分化的多种生长因子和激素的调控，BMPs 是成骨细胞分化和骨形成最有效的诱导因子，可以通过Smads 途径上调Runx2 的表达。过氧化物酶体增殖因子激活受体γ2 抑制其表达和成骨细胞分化，肿瘤坏死因子α、1-25-(OH)2D3、糖皮质激素可能抑制或降低Runx2 的表达。Runx2 亦可通过自身启动子的负调控机制自动调控。Runx2 的表达及功能在鼠的Runx2 启动子区至少有3 个Runx2 识别位点，强制表达Runx2 蛋白可以下调Runx2 启动子活性。一个Runx2 位点就足以抑制转录，这种自我调控严格控制Runx2 的表达从而调控骨相关基因的表达和成骨分化［11］。

4 BMP-2/Smads/Runx2 信号通路

BMP-2 通过结合靶细胞表面2 种丝氨酸/苏氨酸激酶受体(BMPR-I，BMPR-II)

向胞内传递信号。BMP-2 与持续表现激酶活性的BMPR-II 结合后，BMPR-I 能够特异性与此二聚体结合而发生自身磷酸化。BMPR-I 再通过磷酸化Smad1 或Smad5 使其活化，被激活的Smad1 或Smad5 结合Smad4 进入胞核，调节特定基因转录的功能。Smads 蛋白作为共调节子和Runx2 相互作用共同参与成骨细胞表型基因表达和分化。用外源的BMP-2 可以启动信号通路激活Smads 复合物调节下游基因的表达，但是Smads 复合物对基因调节的特异性较低，下游基因的特异表达需要特异性转录因子Runx2的参与［12］。Runx2 可以和骨钙蛋白启动子区的成骨细胞特异性顺式作用元件2 (Osteoblast-specific cis-acting element 2，OSE2)相结合刺激骨钙蛋白的表达，在I 型胶原、骨涎蛋白及骨桥蛋白等成骨细胞相关基因的启动子区都有OSE2 样元件，Runx2 能与这些OSE2 样元件结合激活这些基因表达［13］。

Runx2 能与Smads 蛋白共同调节成骨细胞胶原的表达，Runx2 可以直接结合到OSE2 上转录激活骨钙蛋白基因的启动子。而Smad1 和Smad5 自身不能结合到OSE2 上只有在Runx2 的帮助下才能结合到OSE2 上转录激活骨钙蛋白启动子。Runx2 通过其C 末端的核基质定位信号将Smads 定位在核内活跃转录位点，两者形成复合物与核基质结合共同调控基因表达和细胞分化。该核基质定位信号对Runx2 在核内的精确定位及Runx2 依赖性分化基因的表达调控是必要的。Runx2 C 末端删除纯合小鼠因为成骨细胞成熟受阻而不能成骨，Smads 和Runx2 相互作用并增强Runx2 对靶基因的转录激活活性［14］。

5 相关调节因子

5.1 Smurf 1 Smurf 1 即泛素化调节因子1，属于E3 泛素连接酶家族。它与BMP-2 信号蛋白Smad1、Smad5 及成骨特异性转录因子Runx2、BMPR-I 相互作用，调节这些蛋白质在蛋白酶体中被降解。Chen［15］等研究发现，Smurf1 与BMP-2 激活的Smad1、Smad5 相互作用并调节成骨细胞特异性转录因子Runx2 降解，阐明Smurf1 在体内成骨分化和骨形成中具有特定作用。Xing 等［16］实验发现，Smad6、Smurf1 和Runx2 均位于细胞核，Smad6 与Smurf1 的协同作用可下调Runx2 蛋白水平，为BMP-2/Smads/Runx2 信号通路的负性调节机制。

5.2 Menin Menin 即1 型多发性内分泌腺瘤肿瘤抑制基因产物。作为一种核蛋白，它在转录调节、基因组稳定、细胞分裂和增殖方面发挥作用，可促进多能间充质干细胞分化为成骨细胞，抑制成骨细胞晚期分化。Menin 通过BMP-2/Smad1 (Smad5)/Runx2 级联反应促进间充质干细胞分化为成骨细胞，Menin 与Smad3 共同增强BMP-2 诱导的Smad1/Smad5、Runx2 的转录活性［17］。

5.3 Cthrc1 Cthrc1 为胶原三股螺旋重复蛋白1，作为成骨细胞骨形成的正性调节可使骨量增加。经实验证实Cthrc1作为成软骨组细胞样细胞BMP-2 的下游基因，在活体组织中表达［18］。对于无Cthrc1 鼠或者转基因鼠获得的骨髓细胞集落形成单位的体外研究表明其可以刺激骨组细胞分化和矿化，在无Cthrc1 鼠生长初期碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，I 型胶原和骨钙素(Ostccalcin，OC)表达减少［19-20］。

成骨细胞的分化成熟及矿化是骨发生和骨折等愈合的基础，该过程通过相应的信号传导途径来启动骨特异性转录因子和生长因子的表达，进而促进成骨并完成骨修复功能。BMP-2 信号转导通路在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成骨细胞的分化成熟方面起着至关重要的作用。大量基础实验研究证实，BMP-2 信号通路参与成骨细胞分化以及骨细胞细胞外基质合成与分泌，促进骨形成，增加骨量。研究该通路蛋白和影响通路的相关因子可作为开发抗骨质疏松、骨肿瘤或促进骨愈合药物的靶标，为临床应用提供依据，同时也为药物研究及分子机制提供依据。

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