质谱成像技术在实体肿瘤研究中的应用与展望

杨 琳，王 林，宋三泰，刘晓晴

近年来，质谱成像技术取得了巨大进步，一些研究组报道了质谱成像技术在疾病特别是在肿瘤研究中的应用［1-2］。质谱成像技术被用于分析脑肿瘤、肺癌、乳腺癌等肿瘤的分子分布信息，获取肿瘤特征性分子。此外，质谱成像技术还被用于研究药物及其代谢物等小分子在肿瘤中的空间分布特征。本文就质谱成像技术在脑肿瘤、肺癌和乳腺癌研究中的应用现状进行综述。

1 概述

质谱成像是以质谱技术为基础的成像方法，该方法通过质谱直接扫描生物样品成像，可以在同一张组织切片或组织芯片上同时分析数百种分子的空间分布特征［3-5］。质谱成像技术原理为:在低温环境下，将组织切片黏附于MALDI-MS靶板上，并在组织切片表面喷涂基质，基质与组织切片中的被分析物在原位形成共结晶。随后，将靶板直接送入质谱仪进行检测。当激光照射时，共结晶吸收能量而引起被分析物的离子化。质谱仪对被定义的分析区域扫描并采集离子信息。每一个采集点上获得的信息包括该点的坐标、质荷比以及离子强度的信息。这些信息通过专门的图像分析软件转换处理后，即可获得该区域各个组分的二维离子分布图。组分在每个点上的相对量可用亮度强弱或不同颜色来表示［6-8］。该技术无需任何标记，利用分子质荷比区分不同的分子，寻找差异分子。从这些差异分子中发现的组织特异性标志物可用来区分不同组织及同一组织内的不同成分［5，9-11］。

2 质谱成像技术在实体肿瘤研究中的应用

2.1 脑肿瘤 2001年Stoeckli等［11］首次证实质谱成像技术在肿瘤研究中的巨大潜能，该文论述了如何应用质谱成像技术揭示胶质母细胞瘤组织切片的化学空间结构，该研究结果显示，蛋白胸腺素β4常出现在肿瘤团块增殖最活跃的部分，而蛋白S100A4则出现在肿瘤团块的中心。随后质谱成像技术被证实可直接进行组织分析定位神经胶质瘤，并进行神经胶质瘤的恶性程度分级［12-13］。Chaurand 等［14］论述了如何应用质谱成像技术测定神经胶质瘤中钙结合蛋白S100B含量水平区以分神经胶质瘤的恶性程度。Schwartz等［12］对人神经胶质瘤组织切片进行质谱成像分析，不但能够区分肿瘤组织与正常组织，还能将IV型神经胶质瘤同II型、III型有效区分。在IV型中，S100B(m/z 10 836)蛋白呈明显高表达，这与免疫组化验证实验的结果完全一致。3D质谱成像［15］及 3D 质谱成像同步联合 MRI［11，16］也被应用于脑肿瘤的研究。有研究表明星形细胞磷蛋白Pea15在Ⅲ神经胶质瘤中的水平升高［17］，MRI图像与3D质谱成像均能很好的显示星形细胞磷蛋白Pea15在神经胶质瘤中的空间分布。Sinha等［16］的研究显示，通过对比星形细胞磷蛋白Pea15 3D质谱图像的2D投影图像与不同序列的MRI图像(包括T1加权像、T2加权像、弥散像及脂肪抑制像)以及胶质瘤与瘤旁正常组织的感兴趣区域分析结果，可以看出3D质谱成像区分胶质瘤的能力同MRI一样出色。MRI图像可以显示胶质瘤与正常脑组织间的细胞密度、水及蛋白差异;质谱成像技术则能诠释MRI显示的解剖学结构特征的分子表型，并且能评估这些分子表型的改变是否与肿瘤生长的解剖学改变一致［7］。

质谱成像同样被应用于在脑肿瘤组织中直接分析药物及其代谢物等小分子的空间分布信息［18-19］。近年来，质谱成像在小分子领域的应用还被开发用来检测MRI增强剂的组织分布，并用电感耦合等离子体原子发射光谱方法对实验结果进行验证［20］。靶向MRI增强剂是早期发现疾病标志物的关键工具之一，质谱成像技术能独立提供增强剂的空间分布信息，借此可明确与增强剂结合的靶向性标志物的空间分布特征。

2.2 肺癌 Groseclose等［10］应用质谱成像技术对包含112例针吸活检标本的小型肺癌组织芯片进行了研究。首先，由一位病理学家在光镜下对该组织芯片的HE染色切片进行分析，划分每一例活检标本的癌区、癌旁区和正常组织区。随后，来自相同活检标本的未经病理标注组织芯片与病理标注组织芯片的HE染色切片进行匹配比对，划定未经病理标注组织芯片的癌区、非癌区范围，最后用未经标注的组织芯片进行组织溶解质谱成像。进行质谱成像的组织芯片上，一部分针吸活检组织作为训练组，并用病理学家的诊断对训练组针吸活检组织的质谱信号进行标注，建立分类模型。这个包含73个胰蛋白酶肽峰的基于支持矢量机的分类模型对腺癌的识别准确率为97.9%，对鳞癌的识别准确率为98.6%。

张莹等［21］采用质谱成像技术对非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织分别进行正离子反射模式和线性模式质谱扫描，发现癌组织在m/z 3000～3500范围内有特征簇峰出现。Marko Varga等［22］应用质谱成像成功区分慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)合并肺癌患者肺内癌组织和非癌组织，并明确了异丙托铵在COPD合并肺癌患者肺内的分布情况。Harris等［23］应用质谱成像技术明确了酰基辅酶A结合蛋白在原位及浸润性非小细胞肺癌组织中的分布，该研究显示酰基辅酶A结合蛋白在原位及浸润性非小细胞肺癌中过表达，高表达该蛋白的患者预后差。

近年来，质谱成像还被应用于肺癌治疗药物酪氨酸酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)——吉非替尼和厄罗替尼的研究。Marko Varga等［24］采用压电配药方法使TKI沉积在肺癌组织表面，并对分布于肺癌组织表面的TKI进行质谱成像，以期应用肺鳞癌、腺癌、大细胞癌3种不同的非小细胞亚型建立新的TKI药物代谢动力学模型。研究发现，不论肺癌的病理类型与药物种类为哪一类，间质区的药物信号均较肿瘤区更强。Signor等［25］选用鼠为模型，口服厄罗替尼，剂量5 mg/kg，应用质谱成像研究厄罗替尼及其代谢物在肝脏、脾、肌肉组织中的分布，结果显示厄罗替尼在肝中浓度最高，且在肝中发现了厄罗替尼的代谢物，表明厄罗替尼是在肝中进行代谢的。

2.3 乳腺癌 雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)状态与乳腺癌的诊断及治疗密切相关。近年来，有研究表明，对上述3种蛋白mRNA的多重检测能大幅提升乳腺癌的诊断水平，并指导乳腺癌的个体化治疗［26］。Rauser等［27］证实质谱成像能直接从患者乳腺癌组织明确其HER2状态。对48例乳腺癌组织的质谱成像分析显示HER2状态与特异性多肽/蛋白的表达改变相关，这些多肽/蛋白的表达改变能区分癌组织与正常组织，其敏感性达83%，特异性达92%，总体准确率达89%。富含半胱氨酸的小肠蛋白1被认为是与HER2过表达密切相关的蛋白之一，并被证实应用该蛋白的质谱图像可以建立乳腺癌诊断的新方法。Reyzer等［28］对HER2转基因鼠进行质谱分析，发现了一组能预测分子靶向治疗效果的蛋白，研究结果显示用HER2受体抑制剂Herceptin对患乳腺癌的老鼠进行治疗，当胸腺素β4和泛素下降超过80%时，癌组织出现癌细胞增殖抑制、诱导凋亡及体积减小。同时该研究组应用质谱成像技术证实，这两种蛋白在老鼠体内的分布与抑制剂的分布基本一致，且该预测作用具有时间依赖性和剂量依赖性。质谱成像还被用于分析乳腺癌蛋白表达的异质性［1-2］。Seeley 等［1］的研究表明，同一张乳腺癌组织切片的不同区域会产生不同的蛋白质谱图像，这表明肿瘤中不同种类蛋白质有其特定的空间分布特征，且与正常组织蛋白质的空间分布不同。该研究的对象为发生乳腺癌转移淋巴结，m/z 11 307的蛋白在癌组织和和正常淋巴组织中均有分布，m/z 9004的蛋白仅分布在癌组织浸润最活跃的部位，m/z 5358的蛋白则仅分布于正常组织。Seeley等［2］的另一项研究证实了3种蛋白在乳腺癌组织中的空间分布确有不同:组蛋白H2A集中分布于乳腺导管癌原发部位，calgizzarin主要分布于乳腺导管癌浸润区，而胸腺素β4则集中分布于乳腺导管癌间质中。Dekker等［29］应用质谱成像方法比较乳腺癌患者肿瘤内、外间质区的信号差异，发现了与肿瘤间质活化密切相关的4个蛋白信号，其中一个蛋白信号被确认为PA28。Kang等［30］应用质谱成像串联质谱技术对乳腺癌组织进行研究，发现免疫球蛋白重链A2是乳腺癌微环境的区域特异性蛋白，该蛋白的表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关，表达该蛋白的淋巴结发生转移的风险提升了3.745倍。

质谱成像技术同样被用于组织溶解福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)乳腺癌组织的成像。Ronci等［31］在组织溶解FFPE乳腺癌组织质谱成像研究中探讨了FFPE组织分析的诸多复杂因素，论述了利用原位溶解增加检测到和识别的蛋白质数量的方法，并应用原位溶解质谱成像发现了一组能够准确区分乳腺癌组织和正常组织的胰蛋白酶肽。

质谱成像技术也被用于已知蛋白的靶向性成像。Seuma等［32］利用Au/Ag标记抗体技术及定量元素成像-激光消融电感耦联血浆质谱对已知的备选标志物进行定量成像，证实该方法具有良好的可重复性和定量特性。应用这种已知蛋白靶向性成像研究方法可对近年来发现的大量血清/血浆蛋白谱研究结果进行进一步分析。Callesen等［33］在其发表的一篇应用质谱技术找寻乳腺癌诊断标志物可重复性的综述中认为，尽管各研究的实验设计、实验条件、数据分析方法及分析的可重复性存在差异，但从这些研究中足以找出一组具有良好可重复性的乳腺癌诊断差异蛋白，应用乳腺癌组织芯片的抗体标记靶向性成像方法就可验证这些待确证蛋白是否为乳腺癌诊断差异蛋白。

质谱成像在乳腺癌脂类分子的研究中也有应用。Chughtai等［34］将 MDA-MB-231细胞注射进无胸腺裸鼠体内，待瘤荷达500 mm2时处死裸鼠，应用离子迁移质谱阳离子模式进行质谱成像，明确肿瘤内酰基肉毒碱、鞘磷脂类、甘油磷脂酰胆碱等脂类分布信息。质谱成像的定量研究特性显示，肿瘤组强酰基肉毒碱、鞘磷脂类、甘油磷脂酰胆碱较正常组织存在数量差异。这项关于乳腺癌微环境的脂类组成的研究证实，乳腺癌的脂类组成与乳腺癌的转移密切相关。Kawashima等［35］对9例乳腺癌患者的癌组织和1例正常人乳腺组织进行质谱成像分析，发现了10种由异常脂肪酸组成的磷脂酰肌醇脂类，该组脂类在乳腺癌组织恶性上皮区的分布并不一致，能够区分上皮区的癌组织和周围间质组织。该研究还发现高表达磷脂酰肌醇(18∶0/20∶3)的乳腺癌组织更具侵袭性。Ide等［36］对29例乳腺癌组织进行质谱成像分析，以了解磷脂酰胆碱脂类和溶血磷脂胆碱脂类在乳腺癌组织中的空间分布，结果显示4 种磷脂酰胆碱(32∶1、34∶1、36∶1、34∶0)仅分布在癌组织区，溶血磷脂胆碱脂类在癌区和非癌区的分布并无差异，磷脂酰胆碱(36∶1)∶磷脂酰胆碱(36∶0)的比率和磷脂酰胆碱(36∶1)∶溶血磷脂胆碱(18∶0)的比率在癌区相对于非癌区高。

3 小结

质谱成像技术在肿瘤组织的识别、肿瘤亚型及恶性程度的区分、良恶性肿瘤的鉴别以及肿瘤药物的研究等多个肿瘤研究领域广泛应用，究其原因在于其可以非靶向性地同时研究多种分子的空间分布特征。除多肽/蛋白质外，质谱成像可用于其他多种类型分子的研究，如脂类［37］、代谢物［38］等，只是样本准备方法不同。此外，质谱成像还具备与其他已经建立的体内、体外研究方法联合应用的潜能。目前，质谱成像组织分类均是以组织学分析为基础［8，39-40］。经组织学标记过的组织切片质谱信号被用来创建分类模型，随后用其他切片对该分类模型进行验证。质谱成像可进行组织学类型分类，证明其可被用于临床，并有可能成为新的诊断/预后工具，但要验证质谱成像的这些潜能，还需要进行大样本的实验研究，特别是针对临床人群的研究［39］。同时，质谱成像技术又独立于组织学分析，因此能在病理性实体出现前就检测到生化改变，基于质谱成像技术的对备选蛋白标志物的识别已得到部分研究证实［41-42］。未来基于组织芯片同步分析的分类方法将成为质谱成像发现标志物的主要发展方向，这种高通量研究方法将会使近来备受关注的高速基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)质谱和自动质谱成像得到发展［43］。

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