传代细胞系的支原体污染的检测与去除

夏晴

(上海交通大学生命科学技术学院 上海 200030)

传代细胞株在培养过程中容易感染支原体。感染后细胞不会马上死亡或出现形态变化,有些细胞甚至一点变化都没有,所以往往被研究者忽视[1]。支原体对一般抗生素不敏感,所以污染后去除麻烦。快速高效的检出支原体无论在科学研究还是实际生产中都具有重要意义。

1 支原体污染的检测方法

1.1 培养法[2-3]

此法是将待测细胞株的上清液接入特定液体培养基,经过4-7天的37℃培养,根据培养基PH值的变化来判定结果。但因培养基PH值受内外干扰较多,仍需进行第二步培养,即将上步培养液接入固体培养基中,继续培养。如果确有支原体污染则会有典型的“荷包蛋”式菌落长出。

1.2 DNA染色法[2-3]

DNA染色法具有直观、高灵敏度、操作简单等优点。首先将指示细胞Vero接种到24孔中,培养1天后在每个孔中接种待测样品。培养4天。然后经过固定、染色、封片等步骤,并用荧光显微镜观察,最终判定结果。被支原体污染的细胞经染色后,在荧光显微镜下除了看到有细胞核以外,在细胞核外与细胞周围还可以看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体的DNA,证明有支原体污染。

有些人将这种方法变化,比如直接染色待测细胞等等,但原理都是利用荧光染液结合A-Trich区域的特性。尽管染色直观,利用指示细胞培养可以满足支原体生长的复杂营养要求,操作简单,但检验周期仍需要5天时间,虽然比培养法的检验时间大大缩短,但仍不能满足生产和科研的及时监测要求。另外,DNA染色法最大的弊端在于所污染的支原体必须属于DNA中A-Trich的种属,对于精氨酸类的支原体污染检出效果不佳,要结合培养法才确保结果准确。

1.3 PCR[4-5]

PCR方法检测支原体,首先要把待测细胞裂解,去除抑制物。根据常见污染细胞的支原体的保守序列16S rRNA设计引物,经过合适的PCR反应程序后,电泳,判定最终结果。PCR检测的最大优点是快捷,通常2小时左右即可得出结果。

目前基于PCR检测的研究主要集中在如何更好去除抑制物、设计引物、优化PCR程序等。此种方法主要问题在于容易造成假阴性和假阳性结果,对于重要样品的结果判定还需依赖于培养法和DNA染色法。所以到目前为止,笔者仍未看到类似药典之类的官方检测方法收录PCR方法。

2 支原体污染的去除方法[6-8]

一般情况下,一经发现有支原体污染,最好是及时灭活丢弃。但对于一些珍贵细胞系等被污染后还应难免会考虑将支原体清除。以下列举了最常用的三种方法。另有其它的去除方法几乎都是在下面三种方法基础上的改良和叠加。

2.1 抗生素处理法

抗生素处理目前是最有效、实验室最常用的一种方法。由于支原体没有细胞壁,所以培养细胞时通常加入的那些抗生素如青链霉素等对其杀伤效果不大。目前市场针对支原体污染的抗生素主要有BM-cyclin、MC-210、Ciprofloxacin、M-lasmocin等。用抗生素处理污染的细胞株时会出现一些问题。如处理周期比较长,如BM-cycling整个处理时间需要21天,处理过程中细胞要进行传代,这对于那些有限细胞系来说就要谨慎处理了。经使用MC-210处理只需要7天时间,但有一定的复发率。Ciprofloxacin等相对毒性较大,对细胞损害较大。

2.2 加温处理法

支原体在56℃条件下,30秒内半数死亡,在45℃环境中,l5-30分钟内全部死亡。将污染了的细胞培养物在41℃持续加温,依据支原体种类的不同,加温时间亦有所不同,直至支原体死亡,培养细胞虽也会发生形态的变化,但降到正常温度后可复原。尤其对于普通蛋制苗中支原体污染是一个简便易行的方法。

2.3 巨噬细胞吞噬法

此法适用于救治支原体严重污染的各种珍贵细胞株,一般经过连续几轮的巨噬细胞吞噬处理后,即可消除污染并恢复细胞活力。但由于要经过小鼠腹腔,所以有带入鼠类病毒污染的可能性。

3 展望

如今,体外传代细胞株的培养在生物学的生产和科研领域扮演着极其重要的角色。然而细胞株被支原体污染后难以及时察觉,容易给生产和科研带来严重损失。支原体污染的检测方法既要满足准确的要求又要即可能的缩短检测时间。而对于已污染的珍贵细胞株,要选取一种既可靠又便捷的方式来处理。

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