HPLC法测定哮喘颗粒中苦杏仁苷的含量

苟小军，黄 强

0 引言

哮喘颗粒系临床经验方，是由苦杏仁、麻黄、紫苏子、茯苓、葶苈子、牛蒡子、厚朴、黄芩、柴胡、甘草10味中药组成的复方制剂。方中苦杏仁为主药，具有降气止咳平喘、润肠通便的功效。苦杏仁苷是苦杏仁的主要活性成分，口服后，在酶的作用下，最终分解生成氢氰酸和苯甲醛。但苦杏仁苷口服较大剂量会出现氰化物中毒[1]，且药材市场上充斥着苦杏仁假劣药材的现象，因此，为有效控制哮喘颗粒质量，确保该制剂的疗效与安全，本试验以方中主药苦杏仁的有效成分—苦杏仁苷作为指标成分，采用HPLC法直接测定苦杏仁苷的含量，结果满意，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent高效液相色谱仪(四元泵，DAD检测器，自动进样器)，Agilent1200化学工作站；BP211D型电子分析天平(德国Sartoius)。苦杏仁苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110820-201003)；哮喘颗粒(自制，批号：130312，规格：15 g/袋)；水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1%磷酸水(21∶79)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量10 μL。

2.2 系统适应性试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪中测定。结果苦杏仁苷在20 min内出峰，而且与前后峰均有较好的分离，理论板数在3 000以上。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取苦杏仁苷8.07 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得[2]。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取1 g，精密称定，置于具塞三角烧瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定重量，超声处理30 min，取出，放至室温，称重，用甲醇补充减失的重量，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液[3]。

2.3.3 阴性对照试验 按处方取缺苦杏仁的阴性对照药，按供试品溶液制备方法，制得阴性对照溶液，进样，依法测定，结果阴性对照液在相同位置处无与苦杏仁苷相对应的色谱峰，表明处方中其他药材和辅料不干扰苦杏仁苷的测定。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液3、5、10、15、20 μL进样，以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，苦杏仁苷的回归方程：Y=978.4 X+1.402 4(r=0.999 8)，表明进样量在0.161 4～3.228 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液10 μL，按照上述色谱条件连续进样5次，测定苦杏仁苷峰面积值，计算其RSD为0.97%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、24 h测定苦杏仁苷峰面积，结果RSD为1.02%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性实验 精密称取同一批次的样品6份，按照供试品溶液制备方法得到供试品溶液，按上述色谱条件测定苦杏仁苷的含量，其RSD为1.18%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 采用加样回收法测定，取已知含量的样品(批号：130308)研细，取约1 g，精密称定，精密加入苦杏仁苷对照品适量，制成供试品溶液，依法测定，计算加样回收率。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取3批样品各1 g，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，10 μL进样。结果批号为130308、130312、130315的样品的苦杏仁苷含量分别为3.380 6、3.566 9、3.457 5 mg/g,平均为3.47 mg/g。

3 讨论

3.1 检测指标的选择 苦杏仁苷是常见的氰苷类物质，也是传统中药苦杏仁中的有效成分，迄今已成为医药上常用的祛痰止咳剂、辅助性抗癌药物[4]。在苦杏仁酶和樱叶酶的作用下，苦杏仁苷水解生成野樱皮苷和杏仁氰，后者不稳定，容易生成苯甲醛和氢氰酸。氢氰酸有毒性，摄入过量会与细胞线粒体的细胞色素氧化酶作用，引起细胞抑制而导致死亡[5]。为了确保临床用药安全有效，用含量测定控制制剂及原料药的质量优劣具有重要意义。本试验以苦杏仁苷为指标成分，用HPLC法测定哮喘颗粒中苦杏仁苷的含量。

3.2 流动相的选择 苦杏仁药材中苦杏仁苷的法定测定方法是用甲醇提取并稀释，以乙腈-0.1%磷酸为流动相[6]。为了尽可能避免溶剂峰对试验的干扰，本试验中采用的流动相是甲醇-1%磷酸水(21∶79)。笔者曾比较多种流动相，发现以甲醇-1%磷酸水(21∶79)作为流动相，可使苦杏仁苷峰达到较好分离，峰形较好，理论板数高，故选其作为流动相。

3.3 测定波长的确定 本试验选择苦杏仁苷对照品甲醇溶液在400～200 nm波长用紫外分光光度计扫描，结果在268、258 nm波长处有最大吸收，与植物药有效成分手册中记载一致，但吸收较弱。王乾蕾等[7]以210、225、215 nm为检测波长测定苦杏仁苷，参照药典苦杏仁下的检测波长，结果显示，苦杏仁苷在210 nm下有较好吸收，得到较大的峰面积，故选择210 nm为检测波长。

3.4 提取条件的选定 笔者曾考察甲醇、50%甲醇、乙醇等提取溶剂，结果表明，甲醇提取效果最好；对超声提取时间(10、15、20、30、40 min)进行比较，结果表明，随超声时间延长，含量增加，但 30 min后含量不再增加，故选择超声提取30 min。

参考文献：

[1] 邢国秀,李楠,杨美艳,等.天然苦杏仁苷的研究进展[J].中药材,2003,25(12):1007-1009.

[2] 蒋玉芳,陈宗良,吴立成.HPLC法测定前列安通胶囊中苦杏仁苷的含量[J].中华中医药学刊,2013,31(1):215-216.

[3] 李翔,刘皈阳,马建丽,等.HPLC法测定克咳胶囊中苦杏仁苷的含量[J].中国药师,2013,16(7):1010-1011.

[4] 夏其乐,王涛,陆胜民,等.苦杏仁苷的分析、提取纯化及药理作用研究进展[J].食品科学,2013,34(21):403-407.

[5] 许宁侠.苦杏仁苷的研究进展[J].内蒙古中医药,2012,9:66-67.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:187.

[7] 王乾蕾,李运景,余键,等.高效液相色谱法测定清肺合剂中苦杏仁苷含量[J].中国药业,2008,17(19):31-32.