消瘤平体外诱导人白血病HL-60细胞凋亡及机制研究

詹 飞，李 灿，李瑞生，张玉洁

0 引言

白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤，发病率占儿童恶性肿瘤的第一位。急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)约占儿童急性白血病的20%，尽管目前对儿童ALL的疗效不断提高，但仍有20%～30%儿童的ALL出现复发且通常复发后预后不良，因此，寻找新的抗肿瘤药或化疗增敏剂，有助于改善AML的疗效[1-2]。

消瘤平是由柴胡、炙甘草、黄芩、大枣、法半夏、党参6味中药材提取而制成，柴胡和解少阳，疏肝利胆，通达表里；黄芪、党参为补中益气药，黄芪健脾益气；法半夏调和肝胃(脾)，炙甘草调和诸药，并提高免疫功能。同时，柴胡归属肝经，通过调节肝经的功能以助血滋生[3-4]，因此，消瘤平具有增强机体免疫能力及抗肿瘤的作用。本研究以人淋巴系白血病细胞株HL-60为研究对象，观察消瘤平对该细胞生长、凋亡及凋亡相关基因蛋白的影响，以探讨消瘤平抗白血病的可能作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 洁净工作台(上海净化设备厂)；1815TC型CO2培养箱(美国SHEL-LAB产品)；MK3型酶联免疫检测仪(Thermo Labsystems)；流式细胞仪FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；计算机数据处理软件CELLQUEST(B.D.公司)；低速离心机(日本KUBOTA)。

1.2 药物与试剂 采用水煎法制得消瘤平糖浆剂，HPLC法测得消瘤平中黄芪苷含量为2.32 mg/mL，批号：120315；胎牛血清(德国PAA产品)；RPMI1640培养液(GIBCO产品)常规溶解，过滤除菌，分装后4 ℃保存，使用时加入10%胎牛血清、青霉素和链酶素各100 mL，5%NaHCO3调pH值为7.2，即为RPMI1640完全培养液；溴化二甲噻唑二苯四氮(MTT，Sigma 产品)；碘化丙啶(PI，Sigma公司)；Caspase-3、Fas、Bcl-2酶联免疫检测试剂盒(GDB公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞株 人白血病细胞株HL-60细胞由华中科技大学同济医学院提供，用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液常规培养。

2 方法

2.1 细胞培养 将人白血病HL-60细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例传代，每3 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于试验研究。

2.2 MTT法检测对人白血病细胞生长的影响 取处于对数生长期的HL-60细胞，按常规制成1×105个/mL细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，培养24 h。将消瘤平溶解于1640培养液中，分别加入96孔培养板，使最终每组含消瘤平浓度分别为：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每个浓度设6个复孔，空白对照组加等量1640培养液，继续培养。分别于培养后24、48、72 h 3个时相各取出1块96孔板进行MTT比色实验：每次于实验结束前从各孔中吸出100 μL上清弃去，加入MTT 10 μL(终浓度5 mg/mL)，继续培养4 h后，加入DMSO 100 μL终止反应，振荡10 min，使充分溶解，用酶标仪于波长570 nm处测定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-药物孔A值/对照孔A值)×100%”计算细胞抑制率，以剂量和抑制率绘制生长曲线。

2.3 流式细胞术检测对细胞凋亡和周期的影响 将处于对数生长期的HL-60细胞以1×106个/mL密度接种于25 mL培养瓶中，培养24 h后，分别加入不同浓度的消瘤平和阳性对照药顺铂，对照组加入等量培养液，继续培养48 h后，收集细胞培养上清液，置-20 ℃环境待测相关基因蛋白；常规处理细胞后，用70%预冷乙醇固定细胞，置4 ℃环境中待测细胞凋亡率和细胞周期。检测前，先离心弃上清，再用PBS洗涤后置于柠檬酸缓冲液中1 h以上，调整细胞浓度至1×106个/mL左右，离心弃上清液，加入1 800 μL胰酶消化液，充分作用后加入1 500 μL胰酶抑制酶液(RNASE)，作用数分钟后加入1 500 μL碘化丙啶溶液，15 min后用200目尼龙网过滤，采用美国B&D公司流式细胞仪进行检测细胞凋亡率并分析细胞周期。

2.4 ELISA法检测对凋亡相关基因蛋白的影响 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)检测凋亡相关基因蛋白。取“2.3”中冻存的细胞培养上清，按Caspase-3酶联免疫检测试剂盒说明书进行操作，建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔加入样品稀释液100 μL，第1孔加标准品100 μL，混匀后吸出100 μL移至第2孔。如此反复做对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔吸出100 μL弃去，第8孔为空白对照。待测样品孔加入裸鼠血清100 μL，将板置37 ℃反应120 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，用吸水纸拍干。每孔加入第一抗体工作液100 μL，使充分混匀后置37 ℃反应60 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，加入酶标抗体工作液100 μL，37 ℃反应60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应5～10 min，再加入50 μL终止液混匀，酶联免疫检测仪于490 nm处测吸光度，绘制标准曲线，并计算Caspase-3含量。同法检测Fas和Bcl-2的含量。

3 结果

3.1 消瘤平对HL-60细胞生长的抑制作用 倒置显微镜下观察发现，经消瘤平作用后的细胞排列稀疏，且随着作用时间的延长和药物浓度的增加，细胞密度逐渐减少。不同浓度组的消瘤平对HL-60细胞的增殖均有一定的抑制作用，各药物浓度组细胞生长抑制率与同时间点对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着作用时间的延长，与同浓度组相比抑制率上升，因此，可见消瘤平体外对HL-60细胞的生长抑制作用具有浓度和时间依赖性。具体结果见图1。

3.2 消瘤平对HL-60细胞凋亡的影响 40、80、160 μg/mL消瘤平作用于HL-60细胞后，细胞凋亡率分别为22.37%、31.25%和53.42%，明显高于对照组，随着剂量的增加，细胞凋亡率明显增加，并出现凋亡典型性特征峰。结果见表1。

图1 消瘤平对HL-60细胞增殖的抑制作用

表1消瘤平对HL-60细胞凋亡的影响(n=3)

注：与细胞对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.3 消瘤平对HL-60细胞周期的影响 消瘤平作用于细胞48 h后，细胞周期均受到不同程度的影响，与对照组相比，3个剂量组G2-M期细胞比例均增加，高、中剂量组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；随着药物剂量的增加，G2-M期的比例也增加；G0-G1期和S期略有减少，但与对照组比较差异无统计学意义。提示消瘤平可通过阻滞G2-M期，从而抑制白血病细胞的生长，见表2。

表2 消瘤平对HL-60细胞周期的影响(n=3)

3.4 消瘤平对凋亡相关基因蛋白Caspase-3、Fas和Bcl-2含量的影响 消瘤平3个剂量均可促进Caspase-3蛋白的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组Fas蛋白表达显著高于对照组，Bcl-2蛋白表达则明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 消瘤平对HL-60细胞Caspase-3、Fas和Bcl-2蛋白表达的影响

4 讨论

急性髓细胞白血病是一类来源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，随着化学治疗新药、干细胞移植与生物疗法的开展，急性白血病的治疗取得很大进步[5-6]。但有一部分患者虽经过各种化疗药物治疗仍无法完全缓解，或缓解后在短期内复发，即为难治性白血病。肿瘤的发生、发展以及复发、转移与机体的免疫功能(特别是抗肿瘤能力)低下有关[7]。中药治疗恶性肿瘤，通过扶正祛邪，可增强机体免疫功能，减轻患者放疗、化疗后的临床症状，提高患者术后生存质量，有较明确的抗复发效果[8]。因此，国内外许多学者试图从天然药物中寻找能有效抑制恶性肿瘤细胞增殖的药物或其活性成分用于治疗白血病。

肿瘤患者接受化疗后，常出现燥热伤津所致的阴虚内热或气阴两虚，治以滋阴润燥清热或益气养阴中药而取效[9]。消瘤平糖浆剂是由柴胡、炙甘草、黄芪、大枣、法半夏、党参6味中药制成，已有研究表明[10]，消瘤平对环磷酰胺所致免疫功能低下的小鼠有明显的改善作用，提示其可减轻化疗药物的副作用，在肿瘤辅助治疗中具有一定的应用前景。本实验采用MTT法观察消瘤平对白血病HL-60细胞生长的影响，结果发现消瘤平体外可有效杀伤人白血病细胞HL-60，明显抑制其增殖，与对照组相比差异有统计学意义，浓度越高，抑制作用越强，且随着作用时间的延长，抑制作用也增强，提示消瘤平注射液具有明显的抗白血病活性，作用呈现剂量依赖性。

肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与细胞的死亡速度减慢有关，肿瘤发生的过程必定伴有细胞凋亡这一主动而有序的细胞自我消亡过程[11-12]。在正常情况下，细胞增殖与凋亡保持平衡，当细胞正常增殖和分化被打乱，导致细胞过度增殖和异常时，就会诱发疾病。凋亡不仅直接影响机体组织的正常发育、分化与死亡，其在肿瘤治疗中的作用也受到重视。细胞周期(Cell cycle)是指连续分裂的细胞从一次分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个连续过程，可分为4个周期：S期、G2期、M期、Gl期。

药物抗肿瘤作用机制多与药物诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。参与细胞调控的基因很多，Bcl-2是目前凋亡机制研究的主要靶分子，是重要的凋亡抑制基因，其表达升高，细胞趋向成活。Bcl-2在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，一方面可以阻止肿瘤细胞凋亡，增加恶性细胞数量，另一方面可使正常细胞原癌基因激活，导致细胞恶性化[13-14]。Caspase蛋白家族处于细胞凋亡信号转导的中心位置，而Caspase-3是信号转导通路中的核心效应分子，是最重要的效应性蛋白裂解酶，在许多肿瘤中过度表达，能导致细胞发生一系列凋亡和生化改变[15]。在出现细胞受刺激、损伤或接到死亡指令等信号时，Caspase家族被激活，激活的Caspase-3能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及结构或蛋白，并诱导白血病细胞凋亡。Fas蛋白属Ⅰ型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子超家族成员，广泛表达于人体组织，当膜表面Fas蛋白与其配体FasL结合后，导致Fas空间构象改变，引起死亡诱导信号复合体形成，进而激活Caspase家族，启动蛋白级联反应，诱导细胞凋亡[16-17]。

细胞凋亡激活信号通路十分复杂，不同信号分子之间相互联系，Bcl-2可抑制Caspase-3激活，从而抑制细胞凋亡；Bcl-2也是Caspase-3的底物，可被切断而失去抗凋亡的能力。本研究根据预试验结果，分别用40、80、160 μg/mL的消瘤平处理细胞，结果表明，HL-60细胞凋亡率与消瘤平浓度呈正相关，与对照组比较差异有统计学意义；周期变化也与消瘤平的浓度有关，依次加入不同浓度消瘤平后G2-M%明显升高，而G0-G1%和S%略有降低。ELISA法检测结果显示，不同浓度消瘤平作用后，HL-60细胞Caspase-3蛋白表达随着药物浓度的增加有增高趋势。高浓度还促进Fas蛋白的表达，而Bcl-2蛋白表达低于对照组。提示消瘤平可能通过将HL-60细胞阻滞在G2-M期，上调Caspase-3和Fas蛋白，下调Bcl-2蛋白，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，进而达到抗肿瘤作用，具体机制还有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 李益清,尹松梅,王秀菊,等.mPGES-1抑制剂MK886对白血病HL-60细胞的增殖抑制作用[J].现代肿瘤医学,2013,21(2):249-252.

[2] 熊茂来.siRNA干扰沉默HOXA9基因对急性白血病K562细胞凋亡的影响[J].中国免疫学杂志,2013,29:180-186.

[3] 李达,胡永珍.浅谈调肝扶脾法治疗免疫性血小板减少症[J].中国中西医结合杂志,2011,31(8):1035-1037.

[4] 潘运宝,夏洪平,杨惠玲,等.复方小柴胡汤调控microRNA抑制鼻咽癌细胞增殖[J].分子诊断与治疗杂志,2010,2(5):323-327.

[5] Meads MB,Hazlehurst LA,Dalton WS.The bone marrow microenvironment as a tumor sanctuary and contributor to drug resistance[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2519-2526.

[6] 任莉莉,问明,李淑青,等.参附注射液联合细胞因子对急性髓性白血病细胞来源的树突状细胞诱导生成及功能的影响[J].河北医药,2013,35(6):818-821.

[7] Hadden JW.Immunode ficiency and cancer:prospects for correction[J].Int Immunopharmacol,2003,3(8):1061-1071.

[8] Qi F,Li A,Inagaki,et a1.Induction of apoptosis by cinobufacini preparation through mitochondria-and Fasmediated caspase-dependent pathways in human hepatocellular carcinoma cells[J].Food Chem Toxicol,2012,50:295-302.

[9] 厉秀云,李振民.疏肝健胃清热解毒法治疗胃癌前病变65例[J].陕西中医杂志,2009,30(1):7-8.

[10]张玉洁,吴倩,洪学军.消瘤平对环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制功能的影响[J].实用药物与临床,2013,16(7):555-557.

[11]Vaidya S,Velazquez-Delgado EM,Abbruzzese G,et al.Substrate-Induced Conformational Changes Occur in All Cleaved Forms of Caspase-6 [J].Journal of Molecular Biology,2011,406:75-91.

[12]Smart DJ,Halicka HD,Traganos F,et al.Ciprofloxacininduced G2 arrest and apoptosis in TK6 lymphoblastoid cells is not dependent on DNA double-strand break formation [J].Cancer Biol Ther,2008,7(1):113-119.

[13]Lian H D,Ren B,Gao XW.Effects of minoeycline on expressionof bcl-2,bax in early retinal neuropathy of diabetes in rats[J].Int J Ophthalmol,2011,4(2):162 164.

[14]李丹,魏莎莉,谢怡,等.淫羊藿苷对糖尿病大鼠睾丸中亚硝基谷胱甘肽还原酶及Bcl-2的影响[J].解剖学杂志,2013,36(1):25-28.

[15]王书杰,韦艾凌,张永琴,等.癌痛消方中活血化淤药对大鼠移植性肝癌细胞中Fas、FasL及Caspase-3蛋白表达的影响[J].时珍国医国药,2012,23(10):2401-2403.

[16]Gillan L,Evans G,Maxwell WM.Flow cytometric evaluation of sperm parameters in relation to fertility potential[J].Theriogenology,2005,63(2):445.

[17]邵秉一,于洋,付欣,等.雌激素缺乏导致的骨质疏松发病过程中骨髓间充质干细胞FasL表达降低对CD4+T淋巴细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2013,29(3):515-520.