人参皂苷Rb1通过上调P53和P21抑制PDGF-BB诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖

李 蓉，钟益刚，钱 康

0 引言

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是急性心肌梗死、心衰、卒中等心脑血管疾病的最主要发病原因。AS发生的原因是内皮细胞受到损伤，细胞表面的粘附分子被激活后，导致血液中的单核细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞吸附于内皮，最后渗入血管内膜[1]。还有一个重要原因就是血管中膜的平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMCs)大量增殖并侵入血管内膜[2]。最终发生一系列的免疫反应和炎症反应，使得血管内膜增厚，而血管管腔狭窄。而平滑肌迁移和增殖的一个重要因素是血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)。其不仅能够对平滑肌细胞、成纤维细胞和中性粒细胞产生趋化作用，使得这些细胞迁移到内膜，还能够促进血管平滑肌细胞的分裂和增殖[3]。因此，PDGF在AS的形成过程中发挥着至关重要的作用。如果能够对抗或者抑制PDGF诱导的平滑肌细胞增殖，就可以减缓内膜增厚的进程，甚至可以预防和减缓AS的发生和发展，最终降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。

人参皂苷Rb1(Rb1)是一种提取于人参、田七等名贵中药的皂苷类化合物。Rb1对机体多个系统均有复杂的生物学效应。在心血管系统方面，具有保护血管内皮细胞和预防AS的作用[4]。然而，Rb1能否对抗或者抑制PDGF诱导的血管平滑肌增殖并不完全明确。因此，本研究选择Rb1作为干预因素，通过体内外试验来探讨Rb1对大鼠主动脉血管平滑肌(Rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)增殖的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人参皂苷Rb1(上海经科化学科技有限公司)；PDGF-B(Sigma)；DMEM(Hyclone)；胎牛血清(Hyclone)；MTT(Sigma)；DMSO(BD公司)；P53、P21、CDK2、CyclinE和PCNA单抗购于上海朗顿生物科技有限公司；小鼠α-SM-actin单抗、链霉亲和素-生物素试剂盒(上海碧云天公司)；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂(百奇生物科技有限公司)；SD大鼠25只(南京斯科瑞生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养 RASMCs取自SD大鼠胸主动脉，按照陈雄林等[5]方法进行RASMCs原代培养。细胞传到第3代后，用于后续实验。使用含10%FBS的DMEM培养基进行培养(37 ℃，5%CO2湿润培养环境)。并加入100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素防止细菌污染。α-SM-actin检测对RASMCs进行鉴定和纯度分析。

1.3 MTT实验 用于检测PDGF-BB诱导RASMCs增殖的情况和Rb1抑制PDGF-BB诱导的RASMCs增殖作用。PDGF-BB诱导增殖试验分组(终浓度)：0、2、4、8、16、32 ng/mL共6组。每孔接种细胞浓度为5×104/mL的细胞悬液200 μL，培养24 h后换成无血清培养基200 μL。每组设置6个复孔，加入PDGF-BB后选择24 h和48 h两个检测时间点。加入MTT后继续培养4 h，取上清液加入200 μL DMSO充分溶解，结晶后，于492 nm波长检测OD值作生长曲线图。Rb1抑制PDGF-BB诱导的RASMCs增殖试验分组：0(对照组)、20、40、80 μg/mL组。每孔接种细胞浓度为5×104/mL的细胞悬液200 μL，培养24 h后换成含Rb1无血清培养基200 μL。设置6个复孔，作用24 h。过程同上述MTT操作。结果计算公式：细胞活力=(Rb1作用组/对照组)×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡 用于检测Rb1对PDGF-BB诱导增殖的RASMCs凋亡的影响。将细胞分成4组：PDGF-BB组、PDGF-BB+20 μg/mL组、PDGF-BB+40 μg/mL组、PDGF-BB+80 μg/mL组。于6孔板中接种5×104/mL的细胞悬液(无血清培养基)2 L。PDGF-BB终浓度为16 ng/mL。Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h后消化收集细胞于10 mL离心管，离心(1 000 r/min，5 min)洗涤2遍后1 mL PBS重悬细胞，加入FITC-Annexin V和PI各100 μL。室温避光孵育10 min，上流式细胞仪检测。

1.5 流式细胞术测细胞周期 用于检测Rb1对PDGF-BB诱导增殖的RASMCs周期的影响。细胞分组：对照组(不加药)、PDGF-BB组、80 μg/mL组、PDGF-BB+20 μg/mL组、PDGF-BB+40 μg/mL组、PDGF-BB+80 μg/mL组。具体操作：于6孔板中接种5×104/mL的细胞悬液(无血清培养基)2 L。PDGF-BB终浓度为16 ng/mL。Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h后消化收集细胞，离心(1 000 r/min，5 min)洗涤2遍后用70%冰乙酸重悬细胞，-20 ℃固定过夜。PBS洗涤1次，去上清加入300 μL DNA染液(含碘化丙啶100 mg/L、RNA酶2×104U/L)37 ℃避光染色30 min，然后PBS洗涤2次，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 Western blot 用于检测Rb1作用PDGF-BB诱导增殖的RASMCs后，PNCA、CDK2、CyclinE、P53和P21的蛋白表达情况。分组同“1.5”项下分组方法，Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h。各种抗体浓度分别为：PNCA(1∶1 000)、CDK2(1∶1 000)、CyclinE(1∶1 000)、P53(1∶1 000)、P21(1∶1 200)。具体操作如下：将细胞消化收集于离心管中，离心洗涤2遍，加入裂解液置于4 ℃冰箱1 h后12 000 r/min离心10 min。吸取上清液测蛋白浓度。然后取等量蛋白质溶液行SDS-PAGE电泳，获取蛋白质凝胶条后转印到硝酸纤维薄膜。牛奶封闭后加入相应的单抗摇晃孵育2 h。PBS洗涤孵育单抗的膜条3遍，然后结合HRP-二抗。最后曝光、显影、定影和扫描条带分析光密度。

1.7 动物模型 颈动脉球囊损伤的SD大鼠模型建造参照张纾等[6]的造模方法。水合氯醛麻醉大鼠，固定后颈前正中切开，分离右颈总动脉和颈外动脉，经颈外动脉插入2F球囊导管，注入生理盐水使球囊充盈后缓慢来回推拉球囊导管3次。回抽生理盐水后缝合伤口即可。大鼠分组：正常组、损伤非治疗组、低剂量治疗组[10 mg/(kg·d)]和高剂量治疗组[30 mg/(kg·d)]。采取腹腔注射方式持续给药14 d。

1.8 形态学观察和免疫组化分析 用于观察Rb1治疗大鼠颈动脉球囊损伤后的血管形态改变，分析血管内膜PCNA、P53和P21的变化。处死大鼠后，切取损伤部位颈动脉，置于10%的甲醛中。制作成4 μm切片后，使用HE染色法染色观察。随机选取每只大鼠的3张切片，测量血管管腔面积和内膜面积，并计算平均值，作为该只大鼠的血管形态学计量指标(使用Image-Pro Plus软件)。免疫组化抗体工作浓度：PCNA(1∶200)、P53(1∶100)、P21(1∶100)。切片经脱蜡至水后用上述抗体置于37 ℃孵育30 min进行结合。然后按照链霉亲和素-生物素试剂盒说明进行操作，最后蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片镜下观察。

2 结果

2.1 RASMCs的鉴定 RASMCs经免疫荧光检测，α-SM-actin显示红色，形成的纤维与细胞纵轴平行(见图1，黄色箭头)。细胞核经DAPI染色后显示蓝色(见图1，白色箭头)。随机5个视野计数200个细胞，数3次。细胞无显示红色α-SM-actin为阴性细胞。结果显示RASMCs纯度达(95±1.4)%。

图1 RASMCs免疫荧光分析(×200)

2.2 PDGF-BB诱导RASMCs增殖具有时间剂量依赖性 设置对照组、PDGF-BB组(2、4、8、16、32 ng/mL)共6组。作用RASMCs 24 h和48 h后，应用MTT法检测OD值。结果显示，随着PDGF-BB浓度的增加，细胞活力越来越高，与对照组(0 ng/mL)相比有显著提高(P<0.05，见图2)。而同一个浓度的不同时间点比较，发现48 h细胞活力高于24 h细胞活力(P<0.05，见图2)。表明PDGF-BB诱导RASMCs增殖具有时间和剂量的依赖性。

图2 PDGF-BB对RASMCs增殖的影响

2.3 Rb1能够抑制PDGF-BB诱导的RASMCs增殖 选择16 ng/mL的PDGF-BB作为RASMCs的增殖诱导浓度。Rb1分4个浓度组：0(对照组)、20、40、80 μg/mL。Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h后MTT法检测并统计分析发现，Rb1作用组细胞活力均比对照组低(P<0.05，见图3)。而且Rb1高浓度组比低浓度组细胞活力低(P<0.05)。表明Rb1能够抑制PDGF-BB诱导的RASMCs增殖，并且具有浓度剂量依赖性。另外，增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是反映细胞增殖的指标。通过检测PCNA可以评价细胞增殖情况。本试验检测PCNA发现，随着Rb1浓度增高，PCNA表达量逐渐减少，并且有剂量依赖性(P<0.05，见图4)。总之，Rb1能够明显抑制RASMCs增殖。

图3 Rb1对PDGF-BB诱导的RASMCs增殖的抑制作用

图4 Rb1对RASMCs的PCNA表达的影响

2.4 Rb1诱导RASMCs的凋亡作用不明显 选择16 ng/mL的PDGF-BB作为RASMCs的增殖诱导浓度，Rb1分组同“2.3”。作用24 h后流式检测细胞凋亡率。结果显示，4组的细胞凋亡率(早晚期)分别为：(3.2±0.3)%、(3.0±0.2)%、(4.3±0.4)%和(2.9±0.2)%。各个组间凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05，见图5)。结合“2.3”项的结果，说明Rb1能够抑制RASMCs增殖，但不诱导细胞凋亡。

图5 Rb1对RASMCs凋亡的影响

2.5 Rb1对PDGF-BB诱导增殖的RASMCs细胞周期的影响 将细胞分成6组：对照组(不加任何药物)、Rb1(80 μg/mL)组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Rb1(20 μg/mL)组、PDGF-BB+Rb1(40 μg/mL)组、PDGF-BB+Rb1(80 μg/mL)组，Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h。流式细胞术检测细胞周期分布。结果显示，单药Rb1对细胞周期影响不明显(见图6-b)；PDGF-BB能够增加S期和G2/M期细胞比例(见图6-c)；随着Rb1的浓度增加，S期细胞逐渐减少，而G0/G1期细胞逐渐增加(见图6-d、e、f)。综上，PDGF-BB能够诱导细胞进入增殖旺盛的S期和G2/M期，而Rb1能够抑制PDGF-BB的这种作用，使细胞阻滞于G0/G1期。

2.6 Rb1对PDGF-BB诱导增殖的RASMCs的CDK2和CyclinE的影响 细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinases 2，CDK2)和CyclinE是细胞由G1期进入S期的关键蛋白。通过检测这两个蛋白的表达，可以了解Rb1在蛋白水平对RASMCs周期的影响。结果显示，PDGF-BB诱导增殖后CDK2和CyclinE的表达上调。当Rb1作用后，CDK2和CyclinE的表达受到抑制，且具有一定的剂量依赖性(P<0.05，见图7)。

图7 Rb1对 RASMCs的CDK2和CyclinE表达的影响

2.7 Rb1对PDGF-BB诱导增殖的RASMCs的P53和P21的影响 P53和P21均为细胞增殖相关信号通路的重要蛋白分子，可以抑制细胞增殖，并且处于CDK2、CyclinE的上游。Rb1作用PDGF-BB诱导增殖的RASMCs后，CDK2、CyclinE明显下调。因此，本试验探讨Rb1是否作用P53、P21而导致CDK2、CyclinE下调。结果显示，与0 μg/mL组比较，P53和P21均有不同程度的上调(P<0.05，见图8)。因此，可认为Rb1上调P53、P21后使得细胞增殖受到抑制。

2.8 Rb1对球囊损伤导致的大鼠颈动脉内膜增厚的影响 将大鼠分成4组：正常组、非治疗组、低剂量治疗组[10 mg/(kg·d)]和高剂量治疗组[30 mg/(kg·d)]。治疗14 d后，测量颈动脉管腔面积和内膜面积。与非治疗组比较，治疗组的管腔面积显著增加，内膜面积减小(P<0.01)。见表1。此外，苏木精-曙红染色后显微镜观察直观可见非治疗组管腔明显狭窄和内膜增厚，治疗后管腔变宽和内膜变薄。见图9。

图8 Rb1对 RASMCs的P53和P21表达的影响

表1 Rb1治疗后比较球囊损伤的颈动脉内膜相关形态计量指标(mm2)

2.9 Rb1治疗后PCNA、P53和P21在大鼠颈动脉内膜的表达情况 免疫组化法检测损伤非治疗组、低剂量治疗组和高剂量治疗组大鼠颈动脉的PCNA、P53和P21的表达。结果显示，低、高剂量治疗组(图10-B、C)的PCNA表达低于非治疗组(图10-A)；而P53和P21的表达高于非治疗组。见图10。此结果与体外实验结果(Western blot法检测)相类似。

图9 Rb1治疗后球囊损伤的颈动脉形态学观察

3 讨论

血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)异常增殖是AS发生的关键因素之一。而在VSMCs异常增殖的过程中，PDGF-BB又起到非常重要的作用。PDGF-BB是一种最有效的细胞有丝分裂原和诱导剂，通过激活与其相关的分子体系导致VSMCs增殖[7]。如：PDGF-BB结合PDGFRβ后，通过激活ERK通路、MAPK通路和PI3K-Akt通路，最终促进VSMCs的增殖[8]。此外，其可以上调MMP-2的表达并导致VSMCs的迁移[9]。而本试验在体外使用PDGF-BB诱导大鼠主动脉平滑肌细胞增殖获得了同样的效果，并且具有时间剂量依赖性。此后，使用Rb1作用PDGF-BB诱导增殖的RASMCs，发现Rb1对其增殖具有抑制作用。Rb1对机体各个系统均有多种作用，而在心血管方面通过对抗氧化和同型半胱氨酸作用使得血管内膜得到保护和修复[10]。而本研究发现，Rb1能够阻滞PDGF-BB诱导增殖的RASMCs于G0/G1，不增加细胞的凋亡。说明Rb1抑制细胞增殖是通过阻滞细胞进入分裂期，而不是诱导细胞凋亡。CDK2和CyclinE是细胞由G1期进入S期的关键分子之一，两者结合后使其下游的pRb磷酸化，最后使得细胞顺利进入S期[11]。通过检测CDK2和CyclinE的表达可以了解药物对细胞周期相关通路的影响。本研究发现，Rb1作用后，RASMCs的CDK2和CyclinE表达受到抑制。进而再检测两者的上游分子P53和P21，结果发现P53和P21表达上调。P53是一种抑制肿瘤发生的转录因子[12]，但同时在细胞周期阻滞中发挥重要作用，它可以激活下游的P21分子，而P21又能抑制CDK2/CyclinE复合体，最终阻滞细胞进入S期。

图10 球囊损伤的大鼠颈动脉的PCNA、P53和P21的表达情况

在大鼠体内实验同样证实了Rb1能够抑制VSMCs增殖，使动脉管腔变宽和内膜变薄。并且检测到PCNA的下调、P53和P21的上调，与体外试验结果一致。

总之，本研究证明了Rb1能够有效抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖，而且是通过阻滞细胞于G0/G1期实现的。而这个过程与P53、P21的上调明显相关。

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