白芍总苷对NAFLD大鼠肝脏的保护作用及其机制研究

金国贤，张 文，孙伟娟，程 程，刘 莹*

0 引言

白芍是芍药的干燥根部，中医理论认为其具有益气、活血的作用。在白芍的干燥根中可分离出芍药苷、芍药花苷、苯甲酰芍药苷等具有生理学活性的糖苷类混合物，统称为白芍总苷(TGP)[1]。目前的研究表明，白芍总苷在人体内会抑制IL-1、TNF-α、细胞间粘附因子-1,阻止胶原蛋白合成或脂类物质的氧化。上述的炎症细胞因子、脂肪细胞因子、胞间粘附因子、胶原蛋白等均是造成非酒精性脂肪肝(NAFLD)的危险因素[2-5]。本研究采用高脂饲料喂养大鼠，构建大鼠NAFLD模型，以探讨白芍总苷对NAFLD大鼠肝脏的保护作用及保护机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，体重130～160 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2012-0004。

1.2 药品和试剂 白芍总苷胶囊(购于宁波立华制药有限公司)；高脂饲料(80%基础饲料+10%猪油+6%胆固醇+4%白砂糖)以及普通喂养饲料(购于广东省医学实验动物中心)；非诺贝特(FEN，购于广州威尔曼药业有限公司)；戊巴比妥钠(山东鲁抗医药股份有限公司)；谷丙转氨酶(ALT)、谷胱甘肽巯基转氨酶(GSH)、谷草转氨酶(AST)测试盒以及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(购自上海研谨生物科技有限公司，批号：20130415)；IL-1、TNF-α、TGF-β(购于上海恒远生物科技有限公司)。

1.3 主要仪器 数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；-80 ℃冰箱；imarkTM酶标仪(美国伯乐有限公司)；高速冷冻离心机(日本SAKULA仪器有限公司)；BS124S分析天平(余姚纪铭承重效验设备有限公司)；紫外可见分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司)。

2 方法

2.1 NAFLD大鼠模型的建立 将50只大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常对照组10只和模型组40只。正常组给予基础饲料，模型组给予高脂饲料喂养。模型建立成功后，根据体重随机分为：模型对照组、非诺贝特组(200 mg/kg)；TGP低剂量组(100 mg/kg)和TGP高剂量组(200 mg/kg)，持续灌胃给药4周，正常对照组以及模型对照组则给予生理盐水灌胃(10 mL/kg)。

2.2 指标检测

2.2.1 血清酶检测 给药干预4周后，各组大鼠禁食24 h，用5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开腹主动脉取血，冷冻离心分离血清，按照ALT、AST、GST、SOD和GSH-PX试剂盒说明书方法测定各血清酶活性，按照试剂盒步骤测定MDA含量[6]。

2.2.2 ELISA方法检查IL-1、TNF-α、TGF-β 采用ELISA试剂盒测定大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β的含量[7]。

2.2.3 组织病理学检查 药物干预4周后，分别从正常对照组、模型对照组、非诺贝特组、TGP低剂量组、TGP高剂量组中随机抽取1只大鼠，取肝左叶，用4%甲醛溶液固定，HE染色，光镜下观察肝脏组织的病理学变化。

3 结果

3.1 白芍总苷对NAFLD大鼠肝功能的影响 与正常对照组比较，NAFLD模型对照组大鼠ALT、AST、GST活性显著升高(P<0.05)；经非诺贝特和白芍总苷干预后模型组大鼠的ALT、AST及GST活性均降低回正常水平，与干预前比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 白芍总苷对NAFLD大鼠的血清ALT、AST、GST活性影响

3.2 白芍总苷对NAFLD大鼠体内抗氧化能力的影响 与正常对照组比较，模型对照组的大鼠SOD、GSH-PX活性显著降低，MDA含量明显升高(P<0.05)；经非诺贝特和白芍总苷干预治疗后，模型组大鼠SOD、GSH-PX活性大大提高，MDA含量显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 白芍总苷对NAFLD大鼠SOD、GSH-PX活性及MDA含量的影响

3.3 白芍总苷对NAFLD大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β含量的影响 由统计学结果可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β的含量显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与NAFLD模型对照组比较，非诺贝特和白芍总苷高剂量组大鼠血清IL-1、TNF-α和TGF-β含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 白芍总苷对NAFLD大鼠血清中IL-1、TNF-α、TGF-β含量的影响

3.4 白芍总苷对NAFLD大鼠肝脏组织结构的影响 经HE染色切片后光镜下观察，正常组大鼠肝脏组织形态学表现正常，肝排列有序，肝索清晰可见，无病理性变化；NAFLD模型对照组大鼠肝细胞出现广泛的脂肪变，明显肿胀呈圆形，细胞核被脂滴挤向一侧，大量肝细胞出现颗粒，肝细胞索排列紊乱；非诺贝特组和白芍总苷高剂量组大鼠肝细胞索排列较整齐，脂滴基本消失，见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理学检查(20×)

4 讨论

NAFLD是指虽无过量饮酒史却类似于酒精性脂肪肝的肝脏组织学病变，目前NAFLD的确切发病机制尚未阐明，可能原因为三酰甘油和脂肪酸沉积在肝组织首先造成肝脏单纯的脂肪性病变，在此基础上，随时间的增加引起慢性的氧化应激反应，造成肝脏细胞和线粒体细胞损伤及炎症反应，促进肝细胞纤维化和坏死[8-13]。异常的细胞因子和氧化应激反应及脂肪过氧化损伤在非酒精性脂肪肝的发展中也起到关键性的作用，其除了能对肝脏线粒体造成不可逆的损伤外，还可以促进炎性细胞因子的形成，诱发细胞凋亡[14-16]。

本实验通过持续给予高脂饲料建造NAFLD大鼠模型，这一模型除使大鼠具有高血压、肝部脂肪堆积的症状外，还可诱发高氧化应激状态和细胞因子的异常形成，而致肝损伤。本实验结果表明，长期给予高脂饲料后，模型对照组大鼠肝功能明显受到损伤，并且抗氧化能力下降，肝脏组织切片可见明显的病理变化，提示肝功能的受损可能与过强的氧化应激反应密切相关。白芍总苷是自白芍中提取的有效活性成分，具有调节细胞因子、抗炎、镇痛、免疫调节及抗心肌缺血的作用。中医学认为，白芍具有养血、通痹的作用，有助于肝功能的改善，近年来，已有研究报道，白芍总苷在糖尿病肾病和免疫性肝炎方面的治疗效果，其可通过上调IL-1、NF-kB、TNF-α、nephrin等细胞因子阻止胶原蛋白合成、抗脂质氧化应激反应，从而改善糖尿病肾损伤和免疫性肝炎损伤[17-19]。在本实验中，白芍总苷组的NAFLD大鼠给药4周后，其抗氧化酶的活性明显提高，血清中异常细胞因子的水平显著下降，通过抗氧化水平的提高以及降低体内异常免疫细胞因子水平，从而使血清中ALT、AST和GST的活性降低到正常值，起到肝脏保护的作用。

由以上分析结果可知，白芍总苷对高脂引起的NAFLD模型大鼠有肝脏保护的作用，其作用机制可能与其提高抗氧化能力、降低异常免疫因子水平有关。

参考文献：

[1] 韩雪,傅继华.抗氧化剂用于非酒精性脂肪肝病治疗的研究进展[J].临床合理用药杂志,2012,5(11):169-170.

[2] 丁效蕙,赵景民.非酒精性脂肪性肝炎的发病机制及治疗的研究进展[J].世界华人消化杂志,2005,13(3):371-375.

[3] 周婷婷,秦波.脂肪细胞因子与非酒精性脂肪肝和胰岛素抵抗关系的研究进展[J].世界华人消化杂志,2009,17(29):3014-3018.

[4] 郑琳颖,潘竞锵,吕俊华.白芍总苷对脂肪肝大鼠增强胰岛素敏感性及抗脂肪肝作用[J].中国中药杂志,2008,33(20):2385-2390.

[5] 赵汝霞.白芍总苷对高脂饮食联合果糖水诱致 NAFLD 大鼠肝脏损伤的保护作用及其机理研究[D].广州：暨南大学,2013.

[6] 李宜川,刘国玲,张玉霞,等.白芍总苷对 NAFLD 大鼠肝脏 NF-kB/p65 蛋白表达及羟脯氨酸含量的影响 [J].聊城大学学报:自然科学版,2013,26(4):62-66.

[7] 刘月丽,吕俊华.白芍总苷的降血脂,抗氧化作用及其对脂肪肝的防治研究[J].海南医学院学报,2012,2:158-161.

[8] 张亚辉,周伏喜,卢放根.大黄素对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗及瘦素作用的影响[J].中国医师杂志,2013,15(8):1044-1047.

[9] Wong VWS,Vergniol J,Wong GLH,et al.Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2010,51(2):454-462.

[10]Cnop M,Havel PJ,Utzschneider KM,et al.Relationship of adiponectin to body fat distribution,insulin sensitivity and plasma lipoproteins:evidence for independent roles of age and sex[J].Diabetologia,2003,46(4):459-469.

[11]Abdelmalek MF,Suzuki A,Guy C,et al.Increased fructose consumption is associated with fibrosis severity in patients with nonalcoholic fatty liver disease [J].Hepatology,2010,51(6):1961-1971.

[12]Ahmed MH,Byrne CD.Modulation of sterol regulatory element binding proteins(SREBPs)as potential treatments for non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)[J].Drug discovery today,2007,12(17):740-747.

[13]Targher G,Day CP,Bonora E.Risk of cardiovascular disease in patients with nonalcoholic fatty liver disease[J].New England Journal of Medicine,2010,363(14):1341-1350.

[14]关丽嫦,徐丽姝,高慧亭,等.利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠模型生化及炎症指标的影响[J].实用医学杂志,2013,29(14):2270-2272.

[15]陈兴梅.非酒精性脂肪肝患者肝损伤与代谢异常及C反应蛋白的关系[J].中国医药,2012,7(4):504.

[16]张艳敏,蒋晓忠,常延河,等.高敏C反应蛋白和血尿酸对2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝的预测价值[J].实用医学杂志,2013,29(2):238-240.

[17]郑琳颖,潘竞锵,杨以琳,等.白芍总苷对非酒精性脂肪性肝病大鼠 Apelin 和 Visfatin 表达的影响 [J].中药新药与临床药理,2013,24(1):51-54.

[18]周艳丽,张磊,刘维.白芍总苷对雷公藤多苷片所致小鼠急性肝损伤保护作用的实验研究 [J].天津中医药,2007,24(1):61-62.

[19]冯瑞儿,郑琳颖,吕俊华,等.白芍总苷对代谢综合征-高血压大鼠改善胰岛素敏感性,降压和抗氧化作用 [J].中国临床药理学与治疗学,2010,(2):154-159.