氯沙坦对大鼠心肌缺血后心脏ACE2蛋白表达的影响

常建梅，崔贞玉，韩素霞，郭李平

0 引言

心肌缺血(Ischemic cardiomyopathy,ICM)具有高发病率、高病死率，严重危害着人类健康，已成为危害人类健康的主要疾病之一。世界卫生组织估计，到2020年，全世界因冠心病所致死亡人数将高达1 110万人[1]。近年来，我国冠心病的发病率增高，且呈年轻化趋势。心肌缺血随着病情的发生发展最终发生心绞痛、心肌梗死、心律失常和心功能下降，严重持久的心肌缺血可致心肌梗死，甚至伴发梗死后恶性心律失常，有导致猝死的风险。本实验旨在通过验证氯沙坦对大鼠心肌缺血后ACE2表达的影响，探讨氯沙坦改善大鼠心肌缺血预后的新的机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体重220～240 g(新疆医科大学实验动物中心提供)。

1.2 主要材料及仪器 氯沙坦(默沙东制药有限公司，科素亚)；小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；电子显微镜(上海蔡司光学仪器国际贸易有限公司)；高速低温离心机(德国Thermo Fhisher)；PB303-N型电子精密天平(德国Thermo Fhisher)；LD4-2型离心机(北京医用离心机厂)；粉碎匀浆机(美国Bio-Rad)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技术有限公司)；PMSF(武汉博士德生物有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(北京百泰克生物技术有限公司)；电泳胶(美国NUPAGE)；NC膜(北京中杉金桥)；蛋白预染Marker(北京中杉金桥，分子量19～118 KD)。XJ-75S脱色摇床(北京生物仪器公司)；蛋白电泳转膜仪(美国Bio-Rad)；Power WaveX340型全自动酶标仪(美国Bio-TEK)；NU-6832E型低温冰箱(德国Thermo Fhisher)；90-1型磁力双向搅拌器(德国Thermo Fhisher)；SH-100型凝胶图像分析仪(美国Bio-Rad)。

1.3 动物模型的建立及标本的采集 建立心肌缺血动物模型：大鼠腹腔麻醉后，用6号可吸收线在距左心耳2～3 mm处部分结扎冠状动脉，使其狭窄；假手术组只在相同位置造成损伤但不结扎冠状动脉。

将心肌缺血模型术后24 h存活的42只大鼠随机分为7组：假手术组(sham，n=6)；14 d模型组(14 d mod，n=6)；28 d模型组(28 d mod，n=6)；14 d小剂量氯沙坦干预组[14 d losa lo，10 mg/(kg·d)，n=6]，14 d大剂量氯沙坦干预组[14 d losa hi，30 mg/(kg·d)，n=6]；28 d小剂量氯沙坦干预组[28 d losa lo，10 mg/(kg·d)，n=6]，28 d大剂量氯沙坦干预组[28 d losa hi，30 mg/(kg·d)，n=6]。小剂量氯沙坦按10 mg/(kg·d)灌胃给药，大剂量氯沙坦组按30 mg/(kg·d)灌胃给药，假手术组及模型组给予等量生理盐水灌胃，各组动物灌胃总容量均为200 g<2 mL。

标本的采集：大鼠腹腔麻醉后，打开胸腔，迅速取出心脏，置于冰上预冷的生理盐水中洗去血液，滤纸吸干水分。切取左心室心肌缺血区域一分为二，一部分组织置于4%多聚甲醛中，HE染色观察其心肌缺血后的病理变化，另一部分组织保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 ACE2蛋白表达 Western blotting法检测ACE2蛋白的表达：蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，定量后各组取45 μg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳1.5 h，0.35 mA恒流转膜5 h，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，分别用ACE2抗体(1∶1 000，92 KD，兔抗)、β-acting抗体(1∶200，47 KD，兔抗)4 ℃过夜孵育，0.05% TBST洗膜3次，每次5 min，对应二抗孵育2 h，0.05%TBST洗膜3次，每次5 min。底物DAB呈色法显色。各蛋白表达水平经全能型凝胶成像分析仪检测分析其吸光度值(A值)，并以与内参的比值作为半定量指标进行各组间的比较。

2 结果

2.1 心肌细胞光镜下结构 HE染色光镜下可见，假手术组心肌细胞内细胞核清晰可见，肌原纤维清晰，排列整齐，横纹清楚，间质纤维无增生。模型组心肌细胞胞质不均匀红染或呈不规则粗颗粒状，间质水肿，中性粒细胞浸润明显，心内膜下心肌细胞弥漫性空泡样变性，尚可见完整细胞核，随术后时间的延长心肌细胞萎缩明显；药物干预组光镜下可见胞质均匀红染，间质水肿、中性粒细胞浸润均较模型组减轻，细胞核完整，未见心肌细胞空泡样变性，呈药物剂量依赖性；以4周大剂量组改善最明显，炎症范围及心肌细胞萎缩面积均较其他组减小。见图1～图8。

细胞核清晰可见，肌原纤维清晰，间质纤维无增生

心肌细胞萎缩，空泡变性，炎细胞浸润

心肌细胞萎缩，炎细胞浸润

细胞将减少，萎缩改变，炎细胞浸润

细胞核清晰可见，肌原纤维清晰，间质纤维无增生

心肌细胞萎缩 心脏瓣膜软骨化，炎细胞浸润

心肌细胞萎缩，心瓣膜软骨化生，炎细胞浸润

心肌细胞萎缩，萎缩范围比其他组减少

2.2 心肌细胞ACE2蛋白表达的结果 Mod组的ACE2表达高于sham组(P<0.01)，且在1个月内呈时间依赖性；氯沙坦组ACE2的表达明显高于Mod组，呈剂量依赖性。即随着用药时间逐渐延长、剂量逐渐增加，ACE2蛋白表达逐渐增多。见图9、图10。

图9 各组大鼠左室心肌ACE2与β-acting的蛋白印迹图

图10 各组大鼠左室心肌ACE2与β-acting的比值

3 讨论

ARB类药物是冠心病治疗中可以降低死亡率、改善预后的药物之一，可以延缓或抑制心室重构。

本实验结果中：模型组大鼠缺血心肌组织中ACE2蛋白表达量较假手术组升高(P<0.01)，呈时间依赖性；氯沙坦进一步增加了ACE2蛋白质的表达量，呈剂量依赖性。即随着用药时间延长、剂量加大，ACE2蛋白表达量增高越明显。模型组的ACE2蛋白表达较假手术组高可能是心肌缺血缺氧状态下RAS激活，ACE水平升高使AngⅡ水平增高，反馈性地引起ACE2的升高。而氯沙坦组ACE2表达的增高提示氯沙坦干预时间越长，心肌缺血大鼠心肌组织中ACE2蛋白的表达量越高，越能改善大鼠缺血心肌的缺血状态。以往研究表明，RAS的过度激活在高血压和心室重构的发生、发展过程中发挥着重要的作用[2-3]。本实验结果也提示ACE2可能通过抑制RAS系统其他成员的过度激活来发挥其改善心肌缺血状态的作用。ACE2是Ang1-7的主要催化酶，Ang1-7具有扩张血管、降低血压、利尿、抑制心肌细胞肥大、抑制血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞增殖等作用[4-6]，并可有效拮抗AngⅡ的生物学效应。生物体在生理状态下即存在一种自我平衡功能，血管紧张素家族成员内部之间也不例外，AngⅠ分别在ACE和ACE2的作用下可以水解产生2种多肽：AngⅡ、Ang1-7，而它们的生理作用完全相反，且达成新的平衡，这种平衡对病理状况下抑制机体血管重构及心肌重塑有着重要的临床意义。

ACE2在心肌组织中高度表达，进一步验证了这一新的RAS成员在心血管疾病病理生理中的重要作用。ACE2对心脏的保护作用已有众多研究证实，有研究者发现，ARB类药物可增加组织中ACE2的含量，使Ang1-7的水平升高，并认为ARB类药物增加ACE2的表达，使ACE2产物增加扩血管、改善微循环、抑制血管内皮细胞增生等治疗效应[7-8]。以上研究均与本研究结果相一致。

血管紧张素受体阻断剂氯沙坦，通过竞争性地结合AT1R，使AngⅡ不能与其第一受体结合，增加了AngⅡ与AT2R结合的几率而促进AngⅡ与AT2结合，扩张血管，从而改善缺血区微循环和逆转心血管重构的生物功能[7]。本实验结果提示，氯沙坦也可以通过增强缺血心肌组织中ACE2的表达来改善心肌的缺血状态。推测氯沙坦是ACE2 表达上调的主要原因，即ARB阻断了AngⅡ与其主要受体AT1R结合，促使AngⅡ与其受体AT2R结合的几率增加，发挥生物效应，同时，游离AngⅡ也是ACE2的主要作用底物，从而反馈性地增加ACE2的表达。目前，本实验结果无法对此假设提供确切的证据，尚需进一步的研究来证实以上推断。

参考文献：

[1] American Heart Association:International Cardiovascular Disease Statistics[J].Dallas,American Heart Association,2008,6(4):12-14.

[2] 王江.ACE/ACE2相互负向调节与心力衰竭心肌重构的关系[D].重庆,第三军医大学博士论文,2007:12-13.

[3] Riccioni G.The role of direct renin inhibitors in the treatment of the hypertensive diabetic patient[J].Ther Adv Endocrinol Metab,2013,4(5):139-145.

[4] Shariat-Madar Z,Mahdi F,Schmaier AH.Recombinant Prolyl carboxy peptidase (RPRCP) activity plasma Prekallkrein (Abstract)[J].Blood,2009,10(6):48-50.

[5] Zhao W,Zhao T,Chen Y.Angiotensin 1-7 Promotes Cardiac Angiogenesis Following Infarction[J].Curr Vasc Pharmacol,2013，29.[Epub ahead of print].

[6] Japp AG,Newby DE.The apelin-APJ system in heart failure Pathophysiologic relevance and therapeutic potential[J].Biochem Pharmacol,2008,75(10):1882-1892.

[7] Burrell LM,Burchill L,Dean RG,et al.Chronic kidney disease:cardiac and renal angiotensin-converting enzyme (ACE) 2 expression in rats after subtotal nephrectomy and the effect of ACE inhibition [J].Exp Physiol,2012,97(4):477-485.

[8] 陈东骊.血管紧张素转换酶与原发性高血压及其靶器官损害的关系[J].岭南心血管病杂志,2009,7(4):12-14.