血必净注射液对自发性细菌性腹膜炎患者Th1/Th2亚群的影响

毛燕群，陈凯红，孙 彤，裴 豪

0 引言

自发性细菌性腹膜炎(Spontaneous bacterial peritonitis，SBP)又称原发性腹膜炎，是指腹腔内无脏器穿孔而发生的急性细菌感染，多因致病菌经血液或淋巴传播而致，SBP的发生主要与肝硬化患者机体免疫力下降、门脉高压、肠壁淤血水肿、肠壁屏障破坏、肠道菌群易位等原因有关。SBP的发生与肝功能的损伤程度密切相关[1]，其反过来又可进一步加重原有病情，并诱发肝性脑病、上消化道出血及肝肾综合征，甚至多脏器功能衰竭等严重并发症而危及生命。因此，SBP的治疗在晚期肝病的治疗中至关重要。本研究探讨了SBP的治疗中应用血必净注射液联合抗菌药物治疗，相对于单独应用抗菌药物治疗，对自发性细菌性腹膜炎患者治疗前、后血清Th1/Th2平衡的变化，以观察血必净注射液对Th1/Th2平衡的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2010年3月至2012年9月在我院传染科住院的乙型肝炎后肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者60例，随机分为2组。血必净组35例，男25例，女10例，年龄27～66岁，平均(47.11±11.35)岁。对照组25例，男18例，女7例，年龄29～65岁，平均(46.92±10.16)岁。SBP的诊断符合2004年美国肝病研究学会肝硬化腹水指南对SBP的诊断标准[2]。血必净组腹水培养阳性5例，其中，大肠埃希氏菌4例，肺炎克雷伯菌1例。对照组腹水培养阳性4例，均为大肠埃希氏菌。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 对照组应用头孢吡肟(深圳立健药业有限公司)静脉注射，2 g/次，2次/d，辅以其他保肝、降酶、退黄、利尿等治疗。血必净组在对照组治疗的基础上加用血必净注射液(天津红日药业股份有限)静脉滴注，50 mL/次，2次/d。排除入组前已经具有重型肝炎的患者，两组均未应用其他免疫增强剂。

1.2.2 试剂和仪器 CY5(吲哚-5-菁)标记的抗CD4单抗、异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)标记的抗CD3单抗、巯基化藻红蛋白(Phycoerthrin PE)标记的抗CD30单抗、鼠抗人IgG1-PE、鼠抗人IgG1-FITC和鼠抗人lgG1-Cy5均为美国EB公司提供，淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)，RPMI-1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)，T细胞分离富聚柱(美国BD公司)，流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER公司的EPICS XL型。

1.2.3 外周血单个核细胞(Peripheral blood monoeuclear cell，PBMC)的分离 所有受试者均于治疗前、治疗第4天及治疗第8天时采取患者外周静脉血4 mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞，无菌玻璃培养皿37 ℃培养30 min，去除黏附于玻璃培养皿的PBMC，以获取悬浮的淋巴细胞。用溶血剂(0.85%氯化铵)溶解细胞，经T细胞分离富聚柱得纯化的T细胞，用20%的小牛血清RPMI-1640培养液调整细胞浓度约2×106/mL。流式细胞术法检测其纯度>98%，台盼蓝拒染法检测其活性>97%。

1.2.4 Thl、Th2亚群的测定 取2支试管，各加入100 μL PBMC悬液。2管分别加入抗CD3-FITC、抗CD4-Cy5、抗CD30-PE(CD4+管)；鼠抗人lgG1-Cy5、鼠抗人IgG1-PE、鼠抗人IgG1-FITC(阴性对照管)。各种标记抗体均为15 μL，混匀，4 ℃避光30 min，磷酸盐缓冲液洗涤2次，各管加入0.5 mL缓冲液，上流式细胞仪检测。以CD3+、CD4+、CD3O-T细胞代表Thl细胞，以CD3+、CD4+、 CD3O+T细胞代表Th2细胞。

1.2.5 血清HBV标志物检测 采用时间分辨荧光定量分析法，试剂盒购自上海科华公司。

2 结果

两组治疗前后血清Th1、Th2的变化见表1。

表1 治疗前后两组血清Th1/Th2的变化

注：与上一个治疗时间段比较，#P<0.05，##P<0.01；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表1可见，治疗前两组患者Th1、Th2及Th1/Th2比较差异均无统计学意义(P>0.05)。两组患者Th1、Th2细胞均于治疗4 d后升至峰值，之后下降。治疗后4、8 d，两组患者Th1细胞水平均有所提高(P<0.05)；两组Th1细胞水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后4 d，两组患者Th2细胞水平均有所提高(P<0.05)；治疗后8 d均降低，与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后4 d、8 d，两组患者Th2细胞水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组患者Th1/Th2比值均持续升高(P<0.01)；治疗后4 d、8 d，两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

根据分泌细胞因子和介导免疫功能的不同，辅助性T细胞主要分为Thl和Th2两大类。Th1细胞又称为促炎性T细胞，可特异分泌干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)等细胞因子；能激活巨噬细胞，引起细胞毒作用，介导细胞免疫应答；可促进迟发性超敏反应，在器官移植排斥反应和自身免疫病的诱导过程中起重要作用；但反应过度也会引起组织损伤。Th2细胞又称为抗炎性T细胞，可特异性分泌IL-4、IL-6、IL-10等Th2类细胞因子，主要辅助B细胞分化成为抗体产生细胞，与体液免疫相关，在过敏反应中起主导作用，介导体液免疫。Th1细胞产生的细胞因子可抑制Th2细胞的增殖分化，并促进Th1细胞的自身分化成熟。反之，Th2细胞产生的细胞因子抑制Th1细胞的增殖分化，促进Th2细胞的自身分化成熟。在正常情况下，二者处于平衡状态，维持机体正常免疫功能。研究表明，Th1/Th2之间的平衡与多数真菌、细菌、病毒等所致的感染性疾病病情变化关系密切。在动物试验中，患腹膜炎的试验大鼠随着腹膜炎的严重程度，其产生IFN-γ和IL-12的能力减弱，Th1/Th2的细胞因子的平衡状态被打破，Th2表型占主导地位[3]。

血必净注射液由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5味中药组成，具有活血化瘀、扶正祛邪、清热解毒、菌毒并治等功效。其主要有效成分包括赤芍、丹参素、红花黄色素A、酚酸、黄酮苷和苯乙基苷类、阿魏酸、芍药苷、原二茶醛等[4-5]。有报道，血必净注射液具有拮抗内毒素、抑制多种炎症介质、改善微循环及凝血功能障碍等作用，可以明显改善外周血中性粒细胞的趋化、吞噬、氧化呼吸爆发功能；同时，强效拮抗内毒素诱导单核/巨噬细胞产生的内源性炎性介质失控性释放，加强单核细胞人类白细胞Ⅱ类抗原(HLA、DR)表达，调节机体的免疫功能，促进免疫功能恢复[6-7]。本研究结果显示，两组患者于腹膜炎症开始时，其Th1、Th2 及Th1/Th2均处于一个较低的水平。其后，由于炎症因子、细菌毒素及免疫系统之间的复杂影响，两组患者Th1、Th2 及Th1/Th2均有明显上升，Th1应答和Th2应答均开始活跃。血必净组Th1细胞在治疗第4天的峰值和治疗第8天的水平均明显高于对照组(P<0.05)，表明血必净组Th1应答明显强于对照组。同时两组患者Th2细胞水平在治疗第4天和治疗第8天时比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示两组患者Th2应答处于一个相似的水平。在Th1/Th2比值上，两组虽均有明显的持续性上升(P<0.01)，但在治疗第4天和治疗第8天，血必净组均明显高于对照组(P<0.01)。两组患者经治疗后，其Th1/Th2平衡明显向Th1优势漂移，而血必净组的Th1漂移更加明显。以上研究结果提示，血必净注射液可以明显促进乙型肝炎后肝硬化合并原发性腹膜炎患者的Th1应答，结果即为腹腔炎症可以被更加迅速、有效地控制。这些免疫反应与血必净注射液的抑制炎性介质、改善感染时的特异性免疫功能状态有关，而其改善微循环、拮抗内毒素以及抗细胞凋亡、改善组织器官血液循环、增加组织氧代谢的作用[8-9]亦可以保护腹膜炎患者脆弱的肝、肾功能，避免感染导致的肝功能损伤迅速加重，减少重型肝炎的产生及肝肾综合征的发生，从而进一步减少病死率。

综上所述，血必净注射液可以改善促炎/抗炎反应平衡，促进炎症吸收，同时更好地保护患者肝、肾功能，降低患者的病死率。因此，在自发性细菌性腹膜炎患者的治疗中，配合应用血必净注射液具有一定的临床意义。

参考文献：

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