蛋白激酶B结构与功能研究进展

李 欣

(成都大学 体育学院，四川 成都 610600)

0 引 言

蛋白激酶B 又名Akt，分子量为56 道尔顿，因其具有与蛋白激酶A 与C 的高度同源性而被命名为蛋白激酶B.随着小鼠胸腺瘤中的反转录病毒v-Akt 的提纯，同源基因c-Akt 也被发现，其编码的蛋白产物能使丝氨酸/苏氨酸磷酸化，称之为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt.研究发现，人类至少存在3 种Akt 家族成员:Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ 和Akt3/PKBγ.Akt1/2/3 分别位于14 号染色体短臂3 区2 带，19 号染色体短臂1 区3 带和1 号染色体短臂4 区4 带［1］.Aktl 和Akt2 在人体的大脑、胸腺与心肺中广泛分布，水平较高，而Akt3 则主要在人体的大脑和睾丸中表达，在心肺、脾和骨骼肌中水平较低.该3 种异构体均有相似的催化功能域，可被第二信使调节，是细胞生长信号通路中的传感器，在生长因子或胰岛素介导的信号转导中扮演重要角色，在营养代谢、细胞生长、转录调控和细胞存活中也具有重要作用.

1 PKB 结构

3 种Akt 的异构体都包含相同的保守功能域结构:N 端的PH 功能域，中间的激酶催化功能域和C端含疏水基序的调节功能域.PH 功能域包括大约100 个氨基酸，可与细胞膜上由PI3K 产生的PIP3的头基结合，并存在PDK1 的结合位点，阻断这种结合会加重AGC 激酶活化环的磷酸化［2］.PKB 的催化功能域在分子的中间区域，与PKC、P70S6K 等AGC 激酶高度相似，该功能域的氨基小叶中存在一个活化环，在活化环中的DFG 和APE 基序间有一个保守的苏氨酸残基308，该残基的磷酸化可部分激活PKB［3］.所有PKB 异构体C 端均有一个约40 个氨基酸的延伸片段，该区域含有疏水基序(hydrophobic motif，HM).人体PKB 的HM 序列为:苯丙氨酸/脯氨酸/谷氨酰胺/苯丙氨酸/丝氨酸/酪氨酸.当PKB 的HM发生缺失突变时，Akt 的酶活性会完全丧失.最新的研究表明，HM 对于PKB 的激酶催化活性具有变构调节作用，催化功能域的氨基小叶和αB 螺旋、αC螺旋以及β－5 片状结构形成一个疏水性的磷酸化袋状结构，HM 通过与该结构的结合，增强催化功能域的稳定性，提高磷酸基团的转移率［4］.

2 PKB 的磷酸化调节

PKB 含有2 个特殊的磷酸化位点，Akt1 的苏氨酸残基308 位于激酶催化功能域的活化环上，而丝氨酸残基473 则位于C 端调节域中.Akt2 的相应残基为苏氨酸309 和丝氨酸474，而Akt3 由于只有454 个残基，其相应的残基位为苏氨酸305.PKB 被IGF－1 信号通路激活时，伴随着苏氨酸残基308 和丝氨酸残基473 的磷酸化，当使用PI3K 抑制剂时，残基的磷酸化和PKB的激活同时消失.当苏氨酸残基308 和丝氨酸残基473 发生丙氨酸突变时，PKB 的活性下降85% ～95%.而当苏氨酸残基308 或丝氨酸残基473 发生天冬氨酸突变时，PKB 的活性可增大5 倍.两者同时发生天冬氨酸突变时，PKB 的活性可增大20 倍.苏氨酸残基308 发生单磷酸化时，若丝氨酸残基473 未被磷酸化，C 端小叶上的αB 和C螺旋以及活化环会发生紊乱;若丝氨酸残基473 发生天冬氨酸突变时，激酶催化功能域会从无序转化为有序，导致激酶催化功能域稳定在激活状态.苏氨酸残基308 的磷酸化可部分活化PKB，丝氨酸残基473的单独磷酸化则对PKB 的活性基本无效，但PKB的完全激活则需要丝氨酸残基473 的磷酸化.苏氨酸残基308 是被PDK1 磷酸化的，但丝氨酸残基473的磷酸化则充满争议.理论上，丝氨酸残基473 的磷酸化和苏氨酸残基308 一样依赖于PI3K，PDK1 应成为丝氨酸残基473 的磷酸化激酶，但敲除PDK1的ES 细胞中丝氨酸残基473 呈现出与野生型细胞相似的磷酸化，而苏氨酸残基308 的磷酸化则完全消除.但过表达的PDK1 可以增加丝氨酸残基473的磷酸化，表明PDK1 可以间接增加丝氨酸残基473的磷酸化.有报道认为，在某种情况下PKB 可以发生自磷酸化以及丝氨酸残基473 被PDK2 磷酸化［5］.此外，ILK 也与丝氨酸残基473 的磷酸化相关，它可以磷酸化丝氨酸残基473，其抑制剂可以阻断PKB 丝氨酸残基473 的磷酸化，这些研究表明，ILK 在丝氨酸残基473 的激活过程中发挥作用，但能否直接磷酸化PKB 则还充满争议.研究表明，酪氨酸磷酸化在PKB 调节中发挥作用［6］.PKB 催化区域中的酪氨酸残基315 和326 可通过PKB C 端的脯氨酸/X/X/脯氨酸模序(X 为任意氨基酸)与Src分子C 端的SH3 功能域结合，导致磷酸化，在胰岛素和过钒酸钠作用下，酪氨酸残基474 会被磷酸化，该残基突变为苯丙氨酸时，会减少苏氨酸残基308的磷酸化程度，使PKB 活性下降55%.PKB 的晶体结构显示，酪氨酸残基474 参与HM 与疏水袋结合的过程，酪氨酸残基474 的芳香环与亮氨酸残基214 相互作用，羟基与精氨酸残基207 形成氢键结合.因此，当474 突变后，HM 与疏水袋亲和力下降，造成PKB 的活性降低.而这也会降低PKD1 与PKB的作用能力.丝氨酸残基473 与酪氨酸残基474 的磷酸化是互斥的，对磷酰氨基酸和胰蛋白多肽的分析显示，两者从不同时磷酸化，这提示磷酸化的丝氨酸残基474 具有阻断残基473 的作用，表明474 残基的磷酸化可以抑制PKB 的活性.由于这些酪氨酸在AGC 激酶中普遍存在，这也可能是AGC 蛋白家族的普遍调节机制.

3 PKB 的上游物质

通常，PKB 在没有受到外界刺激时一般以非活化形式在细胞质中表达，当存在IGF-1 等刺激时，细胞膜上的受体酪氨酸激酶磷酸化，PI3K 信号通路激活，PI3K 是产生第二信使3、4、5 三磷酸磷脂酰肌醇的关键酶，3、4、5 三磷酸磷脂酰肌醇可与PKB 的PH结构域结合，使PKB 从细胞质异位至细胞膜，并发生构象改变.当存在PI3K 抑制剂或PH 功能域缺失时，该异位被阻断.当PKB 异位至细胞膜并发生构象改变后，PIP3 可激活PDK1 的活性，导致PDK1 和PDK2 磷酸化激酶催化功能域活化环上苏氨酸残基308 和调节功能域丝氨酸残基473.磷酸化以及余下的激活过程可被PI3K 的抑制剂渥曼青霉素和LY294002 阻断.丝氨酸残基473 的磷酸化是PKB激活的关键步骤，可稳定其活化状态.当丝氨酸残基473 被磷酸化后，PKB 从细胞膜进入细胞质或细胞核［7］.此外，cAMP-PKA 途径、钙调蛋白激酶和热休克蛋白27 等可以独立激活PKB.

4 PKB 的生理作用

4.1 PKB 可以促进细胞增殖

p21 及其相关家族成员p27 可以通过可逆抑制一些周期素依赖激酶来阻断细胞周期.而PKB 通过磷酸化p21 可以抑制细胞周期阻滞［8］.表皮生长因子受体-2 在乳腺癌和卵巢癌中过表达能激活PKB，PKB 磷酸化p21 的苏氨酸145 残基.该过程本身不影响p21 的抑制作用，但可以阻止p21 进入细胞核，而p21 必须在细胞核中才能发挥其抑制细胞增殖的作用.PKB 还可以调节周期素依赖激酶抑制子p27的转录，激活的PKB 或过表达的PKB 可以降低p27在细胞中的水平，促进细胞增殖［9］.此外，细胞周期进程的关键调节者还包括细胞周期蛋白(D1/D2/D3)，它可以刺激G1 期，其需要细胞周期蛋白激酶4 和细胞周期蛋白激酶6 的活性.细胞周期蛋白受转录水平、翻译和蛋白稳定性控制，许多生长因子促进细胞周期蛋白的转录，PI3K 信号通路在此过程中扮演重要角色.过表达的PI3K 和PKB 可以刺激细胞周期蛋白的翻译率.细胞周期蛋白水平受其从细胞核异位至细胞膜的影响，在细胞膜细胞周期蛋白1 可被蛋白体的泛素化降解，其关键的步骤是由GSK3 磷酸化细胞周期蛋白1 的苏氨酸残基286，这可以促进细胞周期蛋白1 与核输出蛋白染色体区域维持蛋白1 的结合.激活的PKB 可以导致GSK3 的失活，降低GSK3 对细胞周期蛋白1 的磷酸化，保持细胞核中细胞周期蛋白1 的较高水平.E2F 是一种通用转录因子，控制多种DNA 合成及细胞周期调节蛋白基因的转录.在细胞进入细胞周期前，E2F 与袋状分子结合而处于无活性状态.当这些袋状蛋白在细胞周期蛋白和(或)细胞周期依赖性蛋白激酶磷酸化时，E2F 被释放而得以发挥转录调节活性.PKB通过降低p27 的表达，使袋状分子高度磷酸化，促进E2F 的转录活性，使细胞从G1 期进入S 期［10］.

4.2 PKB 可以抑制细胞凋亡

血清和某些生长因子能抑制细胞的凋亡，但它们传递抗凋亡信号的机制尚不清楚.Kennedy 等［10］研究了5 种生长因子的下游底物，Ras、Raf、Src、PI3K 和PKB 的抑制凋亡能力发现，Ras、Raf 和Src都不能传递存活信号，而PI3K 的抑制能促进凋亡，PKB 的活化则能抑制凋亡［11］.PKB 可以通过抑制调节凋亡的蛋白来促进细胞生存，PKB 的底物BAD 可以通过与Bcl-XL的结合来促进凋亡，PKB 磷酸化BAD 可以使BAD 与14-3-3 蛋白结合，阻止其与Bcl-XL结合来抑制凋亡.叉头蛋白家族成员都含有Akt磷酸化的序列，可被Akt 磷酸化.而磷酸化修饰可使叉头蛋白改变其细胞定位，在未被Akt 磷酸化修饰时它们大部分定位于细胞核，促进凋亡相关基因Fas-L 和Bim 的转录，促进细胞凋亡.被Akt 磷酸化活化后，它们从细胞核异位至细胞质与14-3-3 蛋白结合，抑制细胞凋亡［12］.此外，PKB 还可以直接磷酸化并抑制caspase 蛋白酶.大多数caspase 具有PKB磷酸化位点，调节凋亡的关键酶caspase-9 的磷酸化位点为丝氨酸196.PKB 可以磷酸化caspase-9 从而阻断内源性蛋白酶活性，在凋亡控制过程中发挥重要功能.过表达的活性PKB 还可磷酸化凋亡信号调节激酶I 的丝氨酸残基83，抑制其活性，并降低具有促凋亡作用的JNK 的活性.

4.3 PKB 促进胰岛素信号应答

PKB 是PI3K 的关键下游效应子，PKBβ 在脂肪组织等胰岛素应答组织中高表达，是保证糖原正常合成的关键基因［13］.PKBβ 缺乏的小鼠表现出典型的II 型糖尿病特征，以及肝脏和肌肉出现胰岛素抵抗.随着胰岛素水平增高，胰岛的体积和数量发生显著增加.糖原合成酶激酶3 在胰岛素刺激时可以磷酸化灭活糖原合成酶，该激酶是PKB 的底物，GSK3α 和β 的磷酸化位点丝氨酸21 和丝氨酸9 均可被PKB 磷酸化而失活.PKB 的PI3K 依赖形式介导该过程，构成了胰岛素调节糖原合成信号通路中的重要旁路［14］.研究表明，PKB 磷酸化灭活GSK3后，可以导致肝脏和脂肪组织葡萄糖和氨基酸转化为糖原和蛋白质.PKB 可以磷酸化激活脂肪组织中的cAMP-磷酸二酯酶3B 丝氨酸残基273，导致磷酸二酯酶3B 的激活，降低cAMP 的活性以及PKA 的活性，并调节细胞内环核苷酸的水平.心脏6-磷酸果糖激酶-2 可被PKB 磷酸化丝氨酸残基466，导致酶活性增高，促进糖酵解.葡萄糖运输蛋白4 是胰岛素敏感的葡萄糖转运分子之一.在胰岛素的作用下，GluT4 从胞浆向质膜移位.Akt 可以促进葡萄搪的转运和葡萄糖运输蛋白4 向质膜的移位，增加葡萄糖的运输，并可促进脂肪细胞的分化.其可能机制为当存在胰岛素等刺激因子时，PKB 在细胞膜上被PDK1 和PDK2 完全活化，进入特定的葡萄糖运输蛋白4 小泡中，促使其异位至细胞膜上.其他PKB 的底物包括胰岛素受体底物1，它的磷酸化可以抑制PI3K 募集到细胞膜上.在胰岛素长期刺激时，在切断PI3K 活性的负反馈通路中具有重要作用.PKB的过表达在几个胰岛素反应细胞株中可以刺激营养的摄取如葡萄糖和氨基酸，并诱导其基因表达通常介导的胰岛素.

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