糖尿病血管病变机制研究进展

李元建

（作者系中南大学药学院教授、博士生导师）

心血管和肿瘤是目前全世界发病排在数一数二的疾病，接下来第三大疾病就是糖尿病。由于生活、工作等一些因素，糖尿病的发病率已经非常高了，据我国糖尿病协会总结的资料表明，我国糖尿病的发病率达到了9.7%，就是说每十个人里面就有一个得糖尿病，我国将近有一亿糖尿病患者，这是发表在《新英格兰》杂志上的最新数据。从这张图上我们看到，从20岁到70岁，在不同的年龄段，60岁以前，男性的发病率要高于女性；60岁以后，男女性的发病率是差不多的。现在，糖尿病发病呈现低龄化，年轻人的发病率也已经很高了。这是已经确诊的数据，如果加上有倾向还没有确诊的，发病率就更高了。糖尿病所带来的危害很重要的就是它所带来的并发症，它所涉及的器官或者系统，从脑、心、肾等各个脏器，由于血糖增高引发的并发症，比如心肌缺血、下肢缺血，以及一些伤口愈合的延迟（糖尿病引起的溃疡很难愈合），还会引起糖尿病视网膜的病变，会出现一些出血、血动脉瘤，出现视力的减退，很严重的甚至会导致失明，糖尿病肾病可以出现蛋白尿和肾的纤维化，对脑、心、肾等各个脏器都可以影响。糖尿病造成死亡的原因主要是这种血管的并发症。血管的并发症为什么会引起血管的这种损伤，它的机制是什么？现在已经知道，一方面是血管内皮的受损，很多心血管疾病包括动脉粥样硬化、高血压、心衰的时候都有血管内皮的受损，血管新生的能力也受到了严重的损害，导致糖尿病血管病变的发生与发展。这是指一般我们所见到的形态和功能的一些变化。从分子生物学的机制上，现在提出来有氧化应激的学说、有炎症反应的学说和内皮祖细胞衰老的学说。无论是在高血压还是动脉粥样硬化还是肾功能不全中都有血管内皮受损，所谓血管内皮受损就是指一氧化氮生物利用降低，一氧化氮即NO，是1980年佛奇卡（音）发现的一种集体信息分子，1998年获得了诺贝尔奖，它在人的生命活动中起到了重要的作用。糖尿病发生的过程中导致一氧化氮生物利用的降低，一氧化氮生物利用降低的原因是，现在已经知道，一氧化氮是以精氨酸为底物，一氧化氮生成减少无非是下面三个途径：一方面是合成的底物减少，合成的原料减少当然会导致一氧化氮生成的减少；第二，精氨酸在合成一氧化氮的过程中要通过细胞膜的转运体将它转运到细胞里才能够生成一氧化氮，转运体活性降低也会导致一氧化氮生成的减少；一氧化氮很容易被氧化灭活，更重要的一点就是它合成的酶（NOS），合成的量可能减少了，酶需要一些辅因子，辅因子活性降低也会造成一氧化氮生成的减少。我们现在所要讨论的是调节一氧化氮的一种活性物质，叫做内源性一氧化氮合酶抑制物，它能够抑制酶从而使一氧化氮生成减少，内源性一氧化氮合酶抑制物叫做非对称二甲基精氨酸，英文简称ADMA，一氧化氮是以精氨酸为底物，在一氧化氮合酶的作用下，ADMA与精氨酸能够竞争，抑制这种NOS，使一氧化氮生成减少，精氨酸的结构是这样的，如果在两个氮原子上都引入一个甲基，就叫做对称性的二甲基精氨酸，如果是单个氮原子上引入两个甲基我们叫做非对称性二甲基精氨酸（ADMA），那么为什么只研究ADMA而不研究对称性二甲基精氨酸呢？就是由于ADMA在机体里面的浓度很高，而且它抑制NOS的活性较强。现在已经知道，ADMA首先是在蛋白或者是多肽的链上对精氨酸进行甲基化，那么进行甲基化的这种酶分解生成ADMA，而生成的这种ADMA然后在DDAH即二甲基精氨酸二甲胺水解酶中进行代谢，在机体里面主要的代谢途径是通过DDAH这种代谢酶代谢致活，少部分从肾脏排泄。为什么这里要讲我们研究将来寻找药物，有可能通过抑制PRNT使它生成减少，提高DDAH的活性，使其代谢加快，把ADMA这种有害的物质使它生成减少，可能是我们寻找药物的一种新的思路或者途径。

我现在就我们实验室做的一些研究，糖尿病大鼠生化指标的变化，有一些化学药物来诱发糖尿病，一些Ⅱ型糖尿病患者一般临床资料比较。无论是糖尿病的动物还是临床的患者，血糖的空腹水平都是显著增高的，同时一些低密度脂蛋白增高，高密度脂蛋白降低，这些糖尿病有时候可以并发动脉粥样硬化。很重要的是，看糖尿病患者和动物血中的ADMA这种物质的水平会不会发生改变，是不是与血管的损伤存在一些相关的现象，我们就直接检测血中的ADMA，发现糖尿病大鼠血中的ADMA水平和糖尿病患者的ADMA水平都是显著增高的，然后我们就把大鼠的胸主动脉分离出来看它血管舒张的反应，我们用乙酰胆碱来诱发血管的舒张，我们叫做内皮依赖性舒张反应，反映内皮本身功能的一个指标，不同浓度的乙酰胆碱注入血管以后，我们发现糖尿病大鼠血管的反应减弱了，血管内皮的功能受损了。那么前面所做的就是无论是高血压的动物还是高血压患者血中的ADMA都是增高的，而在动物身上我们看到了动物的血管舒张反应是降低的，这种引起内皮受损和舒张反应减弱的机制是什么呢？我们看看ADMA是怎样促进血管内皮细胞受损的。现在国内外学者从不同的角度切入，发现一方面可能抑制了一氧化氮和酶的活性，另一方面ADMA就是一种全致炎因子，能诱导氧化应激，进而促进内皮细胞的消亡。

我们实验室一个博士生以单核细胞与内皮细胞的粘附来作为指标进行研究，因为内皮受损的时候有炎症反应，炎症反应首先是这些炎症细胞粘附在局部来产生反应，所以他发现ADMA细胞的粘附显著增高，如果我们用左旋精氨酸它能够对照ADMA，这种促进粘附的作用就减弱了。细胞间的粘附分子叫做ICAM－1，能够促进单核细胞的粘附，我们就看这些因子的水平变化，在不同时间用不同浓度的ADMA处理了一个单核细胞，看ICAM－1，时间越长浓度越高时分子粘附水平程度越高，处于48小时后，ADMA能够显著地增高ICAM－1，但是处于72小时时，作用就不明显了。

在调节炎症的过程中，一种重要的因子叫做NF－KB，这种因子是在炎症反应的过程中一种重要的调节因子，这种因子活性增高的话，就会促进炎症反应。我们进一步看看，细胞与细胞之间是怎样进行一些信号传递的，这些信号传递的功能对维持内皮细胞的功能是很重要的，我们看看内皮细胞损伤以后ADMA内皮间的通讯，我们用荧光黄来作为标志，我们点在培养的内皮细胞上，它就能够通过细胞间进行传递。如果细胞没有受损的时候，我们一划痕他们就能向周边传递，如果我们加用了溶血性凝滞型胆碱（LPC），它就能够损伤内皮细胞，我们划痕之后荧光黄就不能扩散。前面我说过DDAH能够代谢ADMA，它能分解使它适合，现在，我们把内皮细胞用分子生物学的方法高表，如果高表以后再用LPC来处理，所有的就显著减弱了。本来它能够损伤内皮细胞之间的通讯，我们现在高表以后，就能够对抗LPC所引起的损伤，LPC就不能使ADMA增高了，加用了这个酶以后，能够代谢ADMA，使它的损伤就减弱了，这就进一步说明了ADMA损伤内皮之间的通讯是通过ADMA所致。这个通讯之间的分子物质是什么？现在已经知道它叫做连接蛋白（CX43），我们看看。LPC是不是引起内皮细胞通讯损伤，影响了蛋白质的表达和生成，使这个参与细胞间通讯的物质受损了，或者是生成减少了，而影响了细胞之间的通讯或者是传递，那么我们就看看这个物质的表达。第一个是在MIA里表达的水平，LPC使DDAH的表达也就是合成的量在MIA里减少了，加入DDAH把内皮细胞固表达以后，那么这种抑制的作用就被取消了，DDAH就代谢了ADMA，把抑制CX43的作用取消了，从而恢复细胞之间表达的量。为了进一步证明，我们直接用ADMA来外源性处理，看它是不是符合我们的假设。讲到这里，我要向同学们介绍，做科研重要的是要提出假设，然后用各种不同的方法来证实自己的假设，所以在科研领域提出问题比解决问题更难；第二，我们说教材，这些教材都是通过反复实践证明了的假设或者说结论，才给同学们来讲授，大学的老师除了要给同学们讲授课程，也要做研究，在这个知识爆炸的年代，知识更新很快，以前大学教材更新10年一个周期，后来变为5年，现在大概是3年一个周期，我们的教材在不断的改版，就是随着科学的发展教材要添入一些新的内容。这是ADMA对内皮CX43MRNA和蛋白表达的量效关系。前面我们讲它为什么会促进内皮细胞的损伤，第一个是它有致炎的作用，第二可以让细胞之间通讯，第三可以诱导氧化应激。现在讲很多的心血管疾病，为什么会引起动脉粥样硬化、心绞痛，为什么糖尿病引起血管内皮损伤？很重要的一个大家公认的机制就是产生了一些氧自由基，一些活性氧，我们叫做氧化应激引起损伤，那么ADMA本身也能够引起氧化应激。为什么ADMA能引起氧化应激呢？现在认为它是eNOS解偶联，eNOS是催化精氨酸生成一氧化氮，现在ADMA抑制了这种酶以后，它不能够生成一氧化氮，就产生了这些超氧阴离子，这些可以直接攻击细胞，攻击它的膜，攻击它的DNA，可以引起它的蛋白的表达水平的降低等等，最终引起细胞的损伤。

如前所述，糖尿病由于血糖的过高，可能引起外周血管的损伤，包括各个脏器的血管的损伤而导致并发症，当血管损伤以后，机体就要修复，糖尿病的病理生理过程中自己的修复能力就减弱了。就内皮细胞的修复来说，内皮祖细胞是很重要的一个物质或者一个细胞，这种细胞因为糖尿病发展的过程中它发生了衰老和功能的减退，也就是说机体内有一群能够分化增殖成熟的内皮细胞我们叫做干细胞，它的另一个名字叫做内皮祖细胞，它可以来自骨髓，也可以来自脐静脉血和外周血，它是在细胞的修复和出生后血管新生中具有重要作用。我们看看，损伤以后，我们机体的参与修复的内皮祖细胞在糖尿病的时候发生了什么变化？如果说这个内皮祖细胞也发生改变的话，我们可以从基因治疗，用内皮祖细胞的生物工程的方法来治疗糖尿病，一方面通过降糖来减少它的损伤，另一方面要保护结构内皮，促进内皮细胞功能的恢复。那么先要研究内皮细胞，我们就要分离出内皮祖细胞，将来便于研究机制，内皮祖细胞分离以后是不是内皮祖细胞要进行鉴定，比如说培养27天以后呈“铺路石样”的排列，形态学上是这样的。它的另一个特点是含有一些生物标记与生物分子，比如说CD31与CD144，这些细胞从分子生物学方法上能够鉴定我们分离的细胞确实是内皮祖细胞，然后我们就来检测看看这些内皮祖细胞是不是衰老了，我们首先在糖尿病的患者以及糖尿病的动物身上来实验。我们现在评价这个细胞是不是衰老有两种酶，一种是单体的酶的活性，另一种酶是EPCs SA-β-gal酶，看看这种酶的活性，如果活性增高的话，说明细胞就发生了衰老，或者是单体酶的活性降低了，细胞就衰老了，我们发现糖尿病患者的EPCs SA-β-gal酶的活性是增高的，所以细胞是发生了衰老的。为了进一步证明糖尿病与血糖有关系，我们直接用高糖来哺育内皮祖细胞，发现随着葡萄糖浓度的增高，造成EPCs SA-β-gal酶的活性增高了，高糖的时候有渗透样的改变，要排除是渗透样的作用呢，还是本身由于高糖所致，我们就要其他物质进行对照，在等浓度的情况下面，对照物是否也引起细胞的衰老？实验的结果并不是由于高浓度的渗透作用引起的，而是由于高糖所引起的内皮祖细胞的衰老。我们进一步看看糖尿病大鼠内皮祖细胞的功能就发现，评价内皮祖细胞的功能有内皮祖细胞的粘附、迁移和tube小管的形成三个方面，我们发现糖尿病大鼠这种粘附、迁移和tube小管的形成的能力都是降低的。我们前面在糖尿病动物和糖尿病患者身上发现了血管内皮的损伤是与ADMA有关系，我们同样看看这种导致内皮祖细胞衰老和功能降低是否也与ADMA有关系，我们用高糖处理了内皮祖细胞以后，看看ADMA、一氧化氮（NO）和DDAH2表达的变化，我们发现ADMA的水平是升高的，NO的水平是降低的，DDAH2的水平是降低的，然后我们再直接看外围一点，ADMA对EPCs SA-β-gal酶活性的影响，我们发现，不同浓度的ADMA处理时，EPCs SA-β-gal酶的活性在0.6毫摩尔时显著增高，说明ADMA就可以直接诱导内皮祖细胞的衰老。

把前面的资料和幻灯片串联起来，我们提出了：高糖可能使DDAH的活性降低，使ADMA增高，使氧自由基（ROS）生成增加，可能促进内皮祖细胞的衰老和功能的降低。

那么，已经知道内皮祖细胞在糖尿病的时候它的功能是降低的，是发生了衰老的，也与ADMA有关系，是不是能找到一些药物来减轻糖尿病的时候内皮祖细胞衰老呢？大家所熟悉的白藜芦醇，就是以前讲得很多的适量喝酒可能对心脑血管有保护作用，白藜芦醇是强抗氧化物质，红葡萄酒里面含量比较高。有人也进行了研究，如果说通过喝酒来达到抗氧化的效果，这个量要很大，大概一次要喝600毫升，这个量可能很难以达到，而且白藜芦醇的半衰期比较短，我们学药学的都知道，药物要维持作用要有一定的稳态水平才能发挥效应，红酒代谢比较快，24小时总要喝酒才能维持它的浓度，显然通过喝酒来达到获取白藜芦醇的目标是不可取的，一般的人还没有达到目的就会醉得差不多了。同时它的脂溶性很低，我们就想能不能对它的化学结构进行改造，我们就引入了一些甲基，BTM-0512这种化合物就是白藜芦醇的衍生物，它的脂溶性就提高了，吸收就增加了，半衰期也延长了，相对比较稳定，我们用它来看看对内皮祖细胞衰老有没有影响。这种假设也不是凭空提出来的，我们前面已经说了，氧化应激是引起内皮祖细胞衰老的主要原因，白藜芦醇具有抗氧化的作用，它作用的机制现在已经知道了，有一种基因叫衰老基因，白藜芦醇是这种基因的激活剂，能够提高这个抗衰老基因的表达，所以有人把一个抗衰老的基因转运到小鼠以后，可以延长它的衰老，这就提示可能对内皮祖细胞衰老有治疗的作用。

我们现在进行研究，看白藜芦醇的衍生物BTM-0512是不是能够抑制内皮祖细胞的衰老，同样我们用BTM-0512酶体活性，发现糖尿病的活性是增高的，能够减轻它的衰老，也能够改善内皮祖细胞的功能，糖尿病的粘附和迁移功能是降低的，加了白藜芦醇的衍生物之后，它的粘附和迁移功能都是增强的，tube小管的形成能力在糖尿病是降低的，两个剂量的白藜芦醇能使它的内皮祖细胞的功能得到改善。为了进一步证明，我们在用高糖处理了以后，看白藜芦醇的衍生物是不是也有抗衰老的作用。前面是在载体动物给氧以后分离的内皮祖细胞，现在是分离内皮祖细胞再用高糖处理，这是两个不同的角度、两个不同的模型，第一个是糖尿病的模型，在体内用高糖把内皮祖细胞分离出来，在载体动物给予特定成分的衍生物，看它的治疗作用，然后回到培养的内皮祖细胞，用高糖来处理，看看这个物质在体外的情况下是不是也有抗衰老的作用。高糖处理以后，酶的活性是增高的，三个剂量白藜芦醇的衍生物能够延缓它的衰老。

现在，我们仍然又回到前面的假说，看看与ADMA是否有关系。我们发现在高糖处理之后ADMA是增高的，较高剂量和中剂量的白藜芦醇的衍生物是能够降低ADMA的水平的。高糖能够使DDAH2的活性及mRNA表达是下调，较高剂量的白藜芦醇的衍生物是能够抑制这种高糖的，起下调的作用。

这是我们一个在美国叫陈红元（音）的校友做了糖尿病小鼠内皮祖细胞衰老与一些内皮祖细胞治疗的工作，这是他2001年发表的文章，用流式细胞的方法来检测，发现糖尿病小鼠内皮祖细胞的数目减少了，同时检测内皮祖细胞里面的氧自由基，看它水平的变化，发现糖尿病小鼠内皮祖细胞的活性氧是增高的。

现在已经知道，机体里面清除氧自由基的酶体有很多，其中有一种重要的酶叫做超氧化物歧化酶（SOD），这里面有 MnSOD，有 CuZnSOD，内皮祖细胞为什么会衰老，可能是与活性氧生成有关，活性氧的增加可能是与代谢活性氧的一些酶的水平活性发生了改变。经检测发现，在糖尿病大鼠的时候MnSOD的活性是降低的，然后进行蛋白的表达，发现MnSOD的活性是降低的，蛋白的表达是降低的，酶的活性是降低的。用高糖处理以后，发现高糖也使这种酶的mRNA降低，内皮祖细胞的氧自由基的生成是增加的。内皮祖细胞衰老影响了糖尿病血管的病变，影响了伤口的愈合，用内皮祖细胞移植看看能不能促进糖尿病伤口的愈合。在小鼠切割以后形成了一个创面，一个正常动物它的伤口会慢慢修复，到第8天的时候伤口就能够愈合，研究的情况就是看在不同的时间糖尿病小鼠和正常小鼠伤口愈合是不是有差异。然后把正常动物的内皮祖细胞分离出来，将它输给糖尿病动物，看它能不能使糖尿病动物的伤口愈合快一些，发现伤口的愈合初步加快了，如果把糖尿病小鼠内皮祖细胞分离出来，再输给糖尿病小鼠，效果就要差了。又进行另外的实验，把糖尿病小鼠内皮祖细胞分离出来以后，把这个内皮祖细胞不表达SOD，实验结果是，正常小鼠伤口在第8天愈合了，糖尿病小鼠的愈合要慢一些，这就反过来证明了输入内皮祖细胞能促进伤口的愈合，说明内皮祖细胞的衰老与SOD的活性有关系。