XAGE-1b基因与肿瘤的关系及研究进展①

龙满美，黄小英，马韵②，姚金光，龙喜带，3③

（1.广西医科大学第一附属医院病理科，广西 南宁 530021 E-mail：longmanmei1989＠163.com；2.右江民族医学院病理学教研室，广西 百色 533000；3.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海 200127）

XAGE-1b基因是XAGE亚科，属于GAGE 家族的一员。这个基因强烈表达于尤文氏肉瘤，腺泡状横纹肌肉瘤和正常睾丸。该基因编码的蛋白含有一个核定位信号，并与其他GAGE／PAGE蛋白质共用一个相似性序列。因为表达模式和序列的相似性，这种蛋白也属于CT（癌- 睾丸）抗原家族。该基因的选择性剪接，除了替代转录起始位点，还产生多个转录变异体。

1 XAGE-1b基因结构

XAGE-1b基因的全称为X 抗原家族，成员1b（X antigen family，member 1b），也称为癌症／睾丸抗原家族12，成员1b（cancer／testis antigen family12，member 1b）。2000 年，Liu等［1］研究发现，XAGE-1基因定位于人类X 染色体短臂，具体位置为Xp11.22，在多种肿瘤中有表达。XAGE-1有4种转录异构体，分别命名XAGE-1a，XAGE-1b，XAGE-1c和XAGE-1d［2］。其中，XAGE-1b是XAGE-1最主要的转录本存在形式，具有表达谱广、表达率高及免疫原性强等特点。从GeneBank了解到，XAGE-1b基因mRNA 表达的相关序列有 三 类：NM ＿001097594.2，NM ＿001097596.2，NM ＿001097595.1。基因组坐标（GRCh37）：X：52，238，809-52，243，953。隶属于长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）类。lncRNA 是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA，能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了X 染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。

2 XAGE-1b蛋白结构及生物学功能

XAGE - 1b 蛋 白 编 码 为 GIFtS：33，GC 地 址：GCOXP052239.XAGE-1b长度约5145bp，其产物是一种含有81个氨基酸的蛋白质，其编码的蛋白质与GAGE／PAGE 家族在COOH 端成员有很强的同源性。

近年来多个研究发现，XAGE-1b被异常激活和成比例地表达于不同类型的肿瘤组织中。在除睾丸、胎盘组织和脑组织以外的正常组织中几乎不表达［3］，但大量表达在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、尤文氏肉瘤、黑色素瘤和横纹肌肉瘤［4］。XAGE-1bmRNA 在肺癌、肝癌、前列腺癌表达近三分之一，但是XAGE-1b蛋白表达似乎仅限于肺癌，尤其是腺癌。因其可引起癌症患者自发地体液免疫和细胞介导的免疫反应，有望成为癌症疫苗。

3 XAGE-1b的调节机制

XAGE-1b调节表达的分子学机制，一直都是科学研究的热点和难点，至今仍不是十分清楚。在过去的十几年中，许多研究人员已经广泛地提及CpG 岛在癌症异常甲基化［5］。抑癌基因启动子中的CpG 位点异常甲基化已经得到传统上认可；甲基化标记，在正常细胞中总是非甲基化，可用于甲基化分析，也可应用于癌症检测。对那些正常的甲基化位点，在癌细胞的异常甲基化的改变，将成为癌细胞本身的标志物。

有报道称，癌症／睾丸抗原的某些相关基因的转录调控是DNA 水平特异的启动子甲基化［6］。XAGE-1的5＇端有一个典型的CpG 岛跨越302 个碱基，应用计算机的程序（MacVector序列分析软件）分析已知的转录因子结合位共同的基因组核苷酸序列，确定了潜在的转录因子在XAGE-1基因启动子区的位点，有许多潜在的Sp1结合位点以及对其他转录因子如Oct-1，C／EBP和NFjB结合位点。通过共转染Sp1的表达载体和XAGE-1的结构，发现Sp1的共转染导致了XAGE-1启动子活性显著增加，从而证实Sp1的作用作为XAGE-1基因启动子的正调控元件［7］。

有学者提出CpG 岛甲基化可能是该基因表达调控的潜在机制，并通过二硫化物修饰的DNA 和COBRA 的测序测定XAGE-1mRNA 的表达在正常细胞和癌细胞相关基因的甲基化状态，揭示了XAGE-1基因启动子甲基化密集的CpG 岛的正常细胞和癌细胞不表达该基因；一旦这种甲基化丢失，该基因则高表达在正常睾丸和癌细胞系中；另外，将XAGE-1基因启动子富含的CpG 岛的片段连接到荧光素酶报告基因，构建并瞬时转染这种构造成HCT116细胞，证实启动子的转录调节活性的区域结合CpG 岛，并证明CpG 岛体外甲基化导致启动子活性的丧失［8］。

总的来说，这些研究表明，在正常和癌组织中XAGE1的表达是由CpG 岛甲基化基因中的启动子调控的。

4 XAGE-1b与肿瘤的关系

4.1 XAGE-1b与尤文氏肉瘤 XAGE-1b是在多种肿瘤组织中表达的CT 抗原，在不同类型的肿瘤基因表达分析表明，尤文氏肉瘤和黑色素瘤中XAGE-1b的表达最高。用Northern印迹和RNA 斑点印迹发现，XAGE-1b高表达在7／8例尤文氏细胞系和4／9例尤文氏肉瘤的患者样本［1］。

4.2 XAGE-1b与黑色素细胞瘤 研究发现在黑素细胞瘤进展的不同阶段，XAGE-1b仅仅表达于转移瘤中（38%，n ＝61），在非典型痣（n ＝10）和原发性黑色素瘤（n ＝8）的表达均为阴性［9］。说明其与肿瘤的侵袭力密切相关，标志着黑色素细胞瘤的进展并可能成为黑色素瘤预后的标志。

4.3 XAGE-1b 与急性白血病 学者通过RT-PCR 检测114例急性白血病患者，分析了XAGE-1的4个转录体基因，发现14／63例（22.22%）急性髓细胞性白血病样本和10／51例（19.61%）急性淋巴细胞白血病样本XAGE-1b的基因呈阳性，提示XAGE-1b基因成比例表达在人类急性白血病，并且其表达和临床特征，如性别、白血病类型之间没有重要关系［3］。

4.4 XAGE-1b与肺癌 近年来，关于XAGE-1b在肿瘤组织中的表达研究逐渐增多。有学者通过免疫组化、免疫荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等方法发现XAGE-1b在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达［10］。XAGE-1b 的特异性CTL对自体XAGE-1b表达阳性的肿瘤细胞比自体XAGE-1b的基因阴性的肿瘤细胞或异体XAGE-1b的表达阳性癌细胞有更强的溶解效果，而该特异性CTL 对正常肺上皮细胞无杀伤活性［11］。这些结果可用于开发简单有效的癌症／睾丸抗原为基础的免疫治疗NSCLC。研究者们调查了XAGE-1b的表达与NSCLC 患者生存期之间的相关性。预先对这些样本HLA I类的表达进行了评估。XAGE-1b的表达与总生存率无相关性；然而，XAGE-1b和HLA I类同时表达，生存时间延长（P ＝0.019）；此外，XAGE-1b的结合下调HLA I类的表达时，生存期缩短（P ＝0.01）；癌巢浸润性肿瘤CD8＋T 细胞表达XAGE-1b和HLAI类的密度明显高于其他组。调查结果表明，XAGE-1b和HLA I类表达引起手术后微小残留病灶CD8＋T 细胞应答，并延长NSCLC 患者的生存期［12］。同时有学者对肺癌的类型及临床特征进行研究，发现XAGE-1基因阳性的肺癌样品为32.94%（28／85），在腺癌样品为59.46%（22／37）和鳞状细胞癌样本为21.74（5／23），这提示XAGE-1b的基因在腺癌中表达明显高于鳞状细胞癌，并提出XAGE-1b基因表达与临床特征之间没有任何重要的相关性，如性别，年龄，临床分期［13］。目前，已有多个学者的研究证明XAGE-1b可以显著表达在NSCLC，尤其是腺癌。因此，XAGE-1b基因是一个可以表达显著频率，并具有免疫原性的NSCLC 的CT抗原。

4.5 XAGE-1b与涎腺腺样囊性癌 Zhou等［14］研究发现，涎腺腺样囊性癌细胞（ACC-M）在体内和体外表达下调与XAGE-1b下调增殖表型相关，并提出XAGE-1b的表达促进了ACC-2细胞在体内和体外的增殖，影响ACC-2细胞在裸鼠体内的转移和跨膜侵袭。XAGE-1b干扰能抑制ACC-M 细胞在体外增殖和裸鼠皮下移植瘤生长，XAGE-1b在ACC-2细胞系中过表达表明其在体内和体外增殖速度更快，跨膜和转移能力更强，并且在肿瘤组织中的血管生成更多。这些研究都提示XAGE-1b的基因能够直接或间接地影响血管生成，导致涎腺腺样囊性癌的发生和转移。

4.6 XAGE-1b与前列腺癌 为了评估癌症疫苗靶向XAGE-1的可行性，有学者［15］研究了XAGE-1转录物的4个变体，及XAGE-1参与前列腺癌患者的体液免疫应答。采用逆转录- 聚合酶链反应（RT-PCR）分析XAGE-1a，b，c，d mRNA在54例前列腺癌标本和8 例良性前列腺增生症（BPH）的表达。观察54例前列腺癌标本，XAGE-1b的mRNA 的表达为14例（25.93%），而XAGE-1a，c和d mRNA 表达分别是1、1和3，在8例BPH 标本未观察到XAGE-1转录物的变体。这表明XAGE-1b在前列腺癌组织的特异性较高，有望成为未来前列腺癌的靶向治疗靶点。

4.7 XAGE-1b与肝癌 Gong L 等［16］通过免疫组织化学检测HCC患者XAGE-1 蛋白的表达，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时RT -PCR 检测来分析XAGE-1基因的表达。在96例HCC患者的组织中检测到XAGE-1三种亚型（XAG-1b，XAGE-1c和XAGE-1d）。三种类型的XAGE-1转录变异体频繁的表达在肝癌组织中并表现出较高的特异性，XAGE-1b，XAGE-1c和XAGE-1d的阳性表达率分别是41.7%（40／96），15.6%（15／96）和26.0%（25／96），XAGE-1b是主要的类型，但在癌旁组织和正常的肝组织未检测到。此外，XAGE-1蛋白在40.6%（39／96）HCC 患者被检测到，但在癌旁组织和正常肝组织未检测到。同时，对XAGE-1的临床相关性表达进行了分析，发现XAGE-1b与患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM 分期、血清AFP水平和感染肝炎病毒无关，并且XAGE-1b阳性的患者2年生存率较低。XAGE-1b在肝癌组织中高表达，尤其是XAGE-1b的特殊性，使其可以预测肝癌患者的预后，有望成为肝癌抗原特异性免疫治疗的新靶点。

5 XAGE-1b的最新进展

研究发现，XAGE-1b在多种肿瘤组织中高表达，是肿瘤免疫治疗的理想靶基因。最新研究表明，XAGE-1b能够显著阻碍黑色素瘤细胞的迁移和侵袭，其在肿瘤的进展过程发挥重要作用，研究者对GAGE 和XAGE-1特定的siRNA 能显著抑制黑色素瘤细胞的迁移进行研究，结果表明抑制SSX4，XAGE1和GAGE在癌细胞系表达干扰了肿瘤细胞的迁移和／或降低细胞生存能力［17］。所观察到的RNAi诱导表型可能是CT 抗原的表达的抑制，而不是一个脱靶效应的结果。这一发现多个siRNA 的不同目标区域相同的基因具有相同的表型效应，表明这些效果确实依赖于基因的枯竭，敲除XAGE1 和GAGE基因观察抑制细胞迁移和侵袭，表明这些基因可能对癌症的靶向治疗有用。使用汞途径分析系统检测到XAGE-1b调控的荧光强度代表位于转录因子下游的信号传导途径。XAGE-1b的过表达通过缩短G0～G1期，延长G2～M 期促进细胞生长，此外，XAGE-1b的过表达通过诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）增强抗凋亡作用［18］。甲胎蛋白（AFP）是HCC 的主要标记物。目前，诊断HCC的主要手段是测定血清AFP的水平。但是，临床上约1／3的HCC患者血清AFP阴性，目前尚无有效的血清学标记物来检测这些患者。有学者研究发现XAGE-1bmRNA 在HCC患者外周血的检出率高达80.8%，在AFP阴性HCC 表达率为82.4%，而且AFP 与XAGE-1b mRNA 的表达不具有相关性，这在很大程度上弥补了AFP 阳性率方面的缺陷，显示出了XAGE-1b mRNA 作为肝细胞癌分子标志物的优越性［19］。因为，XAGE-1b mRNA 在多种肿瘤中表达，所以，它作为诊断HCC 的指标缺乏一定的特异性。因此，AFP与XAGE-1bmRNA 联合检测或许是提高诊断准确率的较好方案［20］。

6 结语

目前，肿瘤的诊断和治疗方式繁多，但真正疗效确切的方式寥寥无几，所以迫切地期待一个有效的方法攻克癌症这一难题。研究发现，XAGE-1b广泛存在于多种恶性肿瘤细胞中，在肿瘤组织中高表达，其与肿瘤的发生、发展及转移关系密切。XAGE-1b抗原具有免疫原性，是肿瘤免疫学和肿瘤生物治疗研究领域重要的研究对象，对肿瘤的免疫治疗和研究有广阔的应用前景。此外，XAGE-1bmRNA 可作为肿瘤的血清学标记物，协助诊断，提高检出率。由于其在肿瘤中的检测仍处于小范围的小样本初期临床研究阶段，目前并未普遍应用到临床中。如果能够大范围开展临床研究，将来可用于一些肿瘤标记物阴性患者的筛查。总的来说，我们对XAGE-1b的认识还十分有限。XAGE-1b对肿瘤的分子机制尚不清楚，可能与CpG岛的甲基化在基因的启动子调节有关。分析XAGE-1b的分子机制，为肿瘤的诊断和治疗找到新的靶点。对XAGE-1b的深入研究将会为肿瘤的诊断与治疗探索出更加有效的方法。未来我们期待能有更多的前瞻性研究来证明XAGE-1b在肿瘤免疫治疗中的价值，及其作为血清学标记物用于癌症诊断的重要意义。

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