猪饲料中黄曲霉毒素多种检测方法的比较

冯艳忠，刘焕奇，沈 伟，王兆山，耿艳红 ，李凤兰，徐会连，秦国庆，陈赫书，王众涛，吴赛辉，郭振华，何鑫淼，王文涛，肖绍科，丁元霞，刘 娣

（1.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086； 2.青岛农业大学，山东 青岛 266109；3.山东省滨州职业学院，山东 滨州256603 ；4.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；5.日本自然农法国际研究中心；6. InnoTech Nutritiom Solutions ， Durand Road Winnipeg；7.山东省梁山县第一职业高级中学，山东 济宁 272605；8.吉林省通化县动物疫病预防控制中心，吉林 通化 134100）

现有饲料原料中霉菌毒素检测技术已经有国家标准，但检测方法费用高、耗时长，难以满足现场快速检测的需要，也无法满足国家对饲料质量安全监管和促进进出口贸易的迫切需要。因此，研究饲料中黄曲霉毒素安全检测与评价技术特别重要，特别是猪饲料中的铜及其他矿物质含量较高，不同的检测方法对结果可能带来一定的干扰，应该引起我们的重视，因为，黄曲霉毒素关系到杜绝畜禽食品安全隐患与危害，促进经济发展，维护社会稳定。

黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层色谱法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法的普遍应用[1]。

1 薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）是测定黄曲霉毒素的经典方法，是我国测定食品及饲料中AFB1的标准方法之一（GB/ T5009.23—1996）[2]。其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，黄曲霉毒素B1、B2产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1、G2产生黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量，是一种半定量检测技术。TLC有单向展开法和双向展开法，其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质，提高灵敏度。TLC法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但由于该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，因而在展开时影响斑点的荧光强度，双向展开法虽避免了杂质干扰，但增加了操作步骤和时间。TLC法较适合于对黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。

薄层色谱法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，准确性差，对实验人员危害大。

2 免疫化学方法

2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是抗原或抗体吸附剂和用酶标记的抗体或抗原与标本中的待测物抗原和抗体起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度，是一种定性的方法。大致采用2种方法检测黄曲霉毒素：一种是用双抗体夹心法；另一种是用竞争法。免疫吸附法测定的试剂盒及配套仪器、方法被列入国家标准GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定”[2]。Holladay等[45]采 取 间 接ELISA技术，检测了抗黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白(AFM1-BSA)免疫原的特异性AFM1抗体。为了使用方便，利用酶联免疫原理研制出黄曲霉毒素快速测试盒，能简便地定量测定黄曲霉毒素含量。赵晓联等[3]应用这种快速测试盒测定黄曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取样品，过滤，收集并水浴挥干提取液，再用甲醇溶解，最后用专用黄曲霉毒素试剂盒测定。关于运用酶联免疫法检测AFB1的检测报道也较多，目前国外已有较成熟的检测食品及饲料中AFB1等真菌毒素的ELISA试剂盒出售，我国自20世纪90年代以来也有一些以ELISA检测食品及饲料中AFB1的研究报道。如刘冬儿[4]报道了食品中AFB1的ELISA测定，线性范围0.25～5.00ng/mL，检测灵敏度达0.015µg/kg，比薄层色谱法提高300～400倍，回收率大于89.2%，精密度高，测定时间短，只需4h。酶联免疫吸附法特异性强、灵敏度高、成本低，适于批量检测，食品和饲料工业上可利用此方法来界定食品或饲料中黄曲霉毒素的超标问题。由于酶本身的不稳定性，用此方法检验黄曲霉毒素有可能带来假阳性或假阴性结果，复杂样品受干扰，检测准确度不高。所以研制出的黄曲霉毒素快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主，酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高。

2.2 放射免疫法

放射免疫法与酶免疫法类似。但放射免疫法存在放射污染，已被淘汰。

2.3 亲合层析法

利用免疫化学原理，抗体选择性吸附抗原物质AFB1，具有高灵敏、高选择、高特异性等特点，提高净化效果及检测灵敏度，减少有毒、有害试剂的使用，有利于操作人员的健康和环境保护。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）是近几年发展起来的检测AFB1方法，主要是用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱，使多种黄曲霉毒素同时分离。文镜[5]采用国产硅镁吸附柱层析分离纯化玉米中AFB1，用HPLC法检测，方法简便，纯化效果好，最低检出量为0.08ng，回收率为92.87%，该法制柱方便，而且降低了成本。李佐卿等[6]则将免疫学技术和HPLC法相结合采用免疫亲和柱对样品进行净化，AFB1回收率达到97.3%，相关系数r=0.9994，最低检出限为6.25pg，该法将提取、净化、浓缩一次完成，大大简化了前处理过程提高了工作效率及方法的灵敏度，但增加了成本。高效液相色谱法灵敏、分辨率高，可作定性、定量分析，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。高效液相色谱法仪器设备昂贵，技术水平要求高，每次实验所使用的化学药剂和处理途径对试验结果影响程度差别很大，对实验结果的精度造成影响；样品还需进行繁琐的纯化处理，不适合快速检测。

4 微柱筛选法

微柱筛选法是将样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，故检测结果为黄曲霉毒素的总量。微柱筛选法测定黄曲霉毒素，主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品。要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验，则需要对不同黄曲霉毒素组分进行分离，再利用其他方法检测。因此，微柱筛选法并不能完成整个黄曲霉毒素的检测过程，仅适用于定性检验。

[1]JaneRoben.Noveltechnologiesforaflatoxindetectionopeningr e m a r k s[C].P r o c e d i n g so fthe2ndFungalGenomics,3rdF um on is inElimin a t i o nan d15thAflatoxinEliminationWorkshops,Texas,2002.54.

[2]GB8381—1987饲料中黄曲霉毒素B1的测定方法半定量薄层色谱法[S].北京：中国标准出版社,1987.

[3]SDHolladay.间接酶联免疫吸附试验检测黄曲霉毒素抗体的评价[J].贵州畜牧兽医,1993,17(1)：46-47.

[4]陈福生,李根久.酱油中黄曲霉毒素的酶联免疫检测[J].中国调味品,1998(8)：26-30.

[5]刘冬儿.酶联免疫吸附分析法测定食品中的黄曲霉毒素B1[J].食品工业科技,2002,23(10)：79-89.

[6]文镜.玉米中黄曲霉毒素B1的硅镁吸附柱层析分离纯化及HPLC的定量分析[J].食品科学,1996,17（1）：68-70.

[7]李佐卿,谢东军,孙大为,等.免疫亲和柱HPLC荧光检测酒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].光谱试验室,2001,18(1)：28-31.