共聚焦激光扫描显微镜在皮肤科的应用

林燕，刘华绪，张福仁

（山东省皮肤病性病防治研究所，济南250022）

反射式共聚焦激光扫描显微镜（Reflectance confocal miscroscopy，RCM）是20世纪80年代发展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器，是近代生物医学图像分析仪器最重要的发展之一，本文简要介绍其结构原理并综述近年来对其在皮肤科应用的研究进展。

1 概述

RCM是美国学者在传统的共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning miscroscopy，CLSM）基础上改进，从而实现了皮肤的在体成像。RCM和传统的CLSM一样，也是采用830 nm的半导体激光点光源代替传统光镜的场光源，是探测点与照明点相对于物镜焦平面是共轭的。只有焦平面上的点同时聚焦于探测点和照明点，焦平面以外的点不会在探测点处成像，即共聚焦，可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜无法达到的分辨力。同时，RCM系统配置的在体扫描装置，可以精确控制逐层对皮肤表皮和真皮浅层进行成像，RCM利用不同层面不同组织细胞结构对光的反射和折射的差异实现的灰度图像。RCM可以实现同一个深度（XY轴）和同一点不同深度（Z轴）的成像，相当于在皮肤活体生理状态下进行无损伤的系列“光学切片”。因而，RCM在中国又被形象地称为“皮肤CT”[1]。

2 RCM在皮肤科的应用

随着技术的进步，RCM可以实现 300～500 μm深度的皮肤在体成像。其具有的和组织学切片相媲美的高分辨率（横向分辨率和侧向分辨率在1 μm）、无创、动态成像、数据易于存储等优点，在皮肤科临床得到了较为深入的推广应用。

2.1 色素性皮肤病 黑素为人体皮肤内最强的自身对照，因此皮肤内黑素异常引起的色素性疾病是RCM检查的最佳适应证，并有助于探讨其发病机制[2]。Rajadhyaksha等[3]在1995年首次提出RCM可以用于色素相关的皮肤病的诊断。

2.1.1 色素减少性皮肤病 白癜风是皮肤科常见的色素脱失性疾病，早期往往与其他色素减退性疾病如贫血痣，无色素痣等难以鉴别，Ardigo等[4]在2007年对16例白癜风患者的白斑区及周围正常皮肤区进行成像，并观察部分病人NB-UVB治疗后的反应，发现如下特点：①白斑区真表皮交界处的高折光的真皮乳头环缺失；②白斑周围外观正常皮肤可呈现程度不同的折光异常，如半环状态；③NBUVB治疗后治疗区可见活跃的高折光的树枝状细胞。刘华绪等[5]对包括白癜风、贫血痣、无色素痣在内的常见色素减退性皮肤病的RCM图像特点进行了分析，发现无色素痣RCM下呈现程度不等的色素减少，但不会出现色素完全缺失情况，而贫血痣相对来说色素减退情况较轻。

2.1.2 色素增加性皮肤病 Liu等[6]对210例黄褐斑皮损进行分析，并对其中的10例同时进行病理学分析，两者的结果基本一致，大多数皮损表现为表皮内黑素颗粒的明显增多，少部分真皮内亦可见少许色素颗粒，基于此研究，黄褐斑可以分为单纯的表皮型和混合型,这对于既往黄褐斑的分型是一个修订。

2.2 接触性皮炎 接触性皮炎根据发病机制的不同可以分为刺激性接触性皮炎和变应性接触性皮炎两类。前者是由于皮肤接触了某种具有刺激性的物质后引起皮肤发疹的一种炎症反应，绝大多数人接触该物质后皆可发病；后者则是对各种产生炎症反应的物质的获得性过敏反应，而且仅见于以前曾接触过该变应原的人。两者临床表现和组织病理特点极为相似，不易区分。只有明确区分后，才能针对不同发病机制进行不同的治疗，可以在明确诊断后，针对不同发病机制进行不同的治疗。RCM可以在体高效地分辨出两者皮肤的改变。Swindells等[7]用变应原和十二烷硫酸钠对22例志愿者进行斑贴试验，并在24，72 h记录RCM图像，结果在刺激性接触性皮炎和变应性接触性皮炎中均可见到海绵水肿，表皮炎症细胞浸润，水疱形成，与变应性接触性皮炎不同的是，刺激性接触性皮炎可以见到角质层严重断裂和大量的角化不全细胞。Astner等[8]应用此项技术研究变应性接触性皮炎的敏感性和特异性,对入选的16例患者的上臂及股内侧皮肤进行过敏原及生理盐水的斑贴试验，发现过敏原斑贴区可见颗粒层及棘层的海绵水肿及炎细胞的移入，其具有95.8%～100%的高特异性，敏感性的范围在51.9%～96.3%，认为RCM是有前途的非创伤性检查技术手段之一。Hicks等[9]研究刺激性接触性皮炎与肤色的关系中，根据肤色的不同将受试者分组，在前臂掌侧分别以1%和4%的十二烷硫酸钠作为刺激物，分别在6，24，48 h进行图像记录，结果发现白种人的临床表现比黑种人严重，进一步印证了深色皮肤对刺激的耐受性比浅色皮肤强。

2.3 银屑病 是一种常见的炎症性皮肤病，患者通常接受各种各样的局部或系统治疗。随着新的免疫调节治疗方法的不断出现，迫切需要一种客观公正的组织病理评价方法。刘华绪等[10]通过对银屑病皮肤RCM成像及组织病理学分析，发现银屑病的几大特点RCM下均可见到，并与病理结果高度一致，如角化过度，角化不全，munro微脓肿，颗粒层的消失或变薄，棘层肥厚，真皮乳头上延，浅层血管扭曲扩张。这种非创伤性检查可以避免传统的组织病理检查中取材对人体的损伤和制片过程中的人为因素的影响，可作为银屑病诊断及治疗随访中的有效监测工具。Wolberink等[11]在银屑病皮损光疗前、9次光疗后、皮损消退时、皮损消退3个月后分别进行RCM成像，并与组织病理学特点相比较，发现两者高度一致，认为RCM可在细胞水平上监测疾病治疗后的反应。

2.4 其他炎症性皮肤病 刘华绪等[12]通过对光泽苔藓的组织学和RCM图像进行对照，首先报告了光泽苔藓的RCM图像特点：扩大的真皮乳头内高折光的噬色素细胞和炎细胞浸润伴有上方的基底层消失。另外，扁平疣、传染性软疣等病毒感染的RCM图像特点也有文献报告[13]。

2.5 皮肤良恶性肿瘤及癌前期病变

2.5.1 基底细胞癌 基底细胞癌是常见的皮肤肿瘤之一，危害人体健康，早期诊断至关重要，可以降低危害和提高生活质量。使用RCM这一既具敏感性又具特异性的非创伤性技术可以做到这一点。Sauermann等[14]对已经病理确诊的12例BCC病人的皮损进行RCM成像，并与其病理特点进行分析，首次总结了RCM下BCC的特点，如血管数目的增加，管腔的扩大，细胞核的拉长并沿一定方向排列等。Nori等[15]在一次回顾性研究中对来自4个组织机构的患者的152处皮肤损害包括良性和恶性制定了5项组织学标准，采用盲法回顾分析了152处皮损的图像。根据这5项RCM诊断标准来判断检查的敏感性和特异性。结果有两项及以上的标准敏感性100%。4项及以上标准的特异性是95.7%，敏感性是82.9%，随着诊断标准增加提高了特异性降低了敏感性，而RCM在基底细胞癌亚型的鉴别需要进一步研究。Agero等[16]也观察了色素型基底细胞癌的一些特征，肿瘤细胞在真表皮处紧密聚集形成结节状结构，瘤细胞在瘤块周围排列成栅栏状，边界不规整，折光不均匀，同时伴有明亮的树枝状细胞结构（黑素细胞和朗格汉斯细胞），噬黑素细胞以及高折光的黑素颗粒。

2.5.2 鳞状细胞癌是发生于皮肤的一种恶性肿瘤，易沿淋巴组织转移到邻近组织。Rishpon等[17]对25例鳞癌患者皮肤进行RCM成像分析，发现表皮细胞排列紊乱，失去其正常的蜂巢样结构；真皮浅层的血管横向扩张是最能提示SCC的关键线索。日光性角化病为好发于暴露部位的一种癌前病变，不经治疗约20%会发展成鳞状细胞癌。Ulrich等[18]对44例病人的46处皮损进行成像分析，发现与病理对应一致的RCM特点包括：角化不全，细胞排列的紊乱，角质形成细胞多形性。其中，结构紊乱及细胞多形性则能较好地提示日光性角化病。

2.5.3 黑素瘤 黑素瘤是一种恶性程度相当高的皮肤肿瘤，一旦诊断应尽早手术切除。Carrera[19]研究认为黑素瘤在RCM下具有很重要的特征性变化，如表皮上皮可见大量paget样细胞及树枝状细胞；真表皮交界处见不典型的肿瘤细胞巢；真皮乳头内可见形态不规则的细胞。色痣是最常见的良性皮肤肿瘤，也是临床上最容易与黑素瘤混淆的疾病。Pellacani等[20]对180例经病理确诊的色痣进行RCM成像，发现其与病理结果具有高度一致性，交界痣痣细胞聚集在真表皮交界处，皮内痣痣细胞团块位于真皮，混合痣兼具两者特点。先天性巨大斑疹被认为容易发展为黑素瘤，Prodinger等[21]研究认为作为一项非侵入性工具，RCM在临床表现模糊不清的斑疹诊断及病情随访中发挥重大作用，可以明确观察细胞的活跃程度。

2.5.4 Paget病 又称湿疹样癌，分为乳房Paget病及乳房外Paget病，临床易与湿疹混淆，一旦确诊应及早切除，因此早期诊断至关重要。Longo等[22]报道一例色素型乳房Paget病，临床表现与黑素瘤相似，RCM下发现表皮上部大量Paget样细胞，表现为核大，低折光的细胞。Pan等[23]进一步对14例病人的23处皮损进行分析，并与病理学对照，发现表皮全层均可见Paget样细胞，具体表现为中等折光的核，其外绕低折光的细胞浆，其体积为正常细胞的两倍大或者更大；在真表皮交界处，可见腺样排列的肿瘤细胞巢，他们亦发现树枝状细胞的密度在色素加深区明显多于红斑区；真皮内可见明显扩张的血管及炎细胞的浸润。其中表皮内Paget样细胞及真表皮交界处肿瘤细胞巢在明确肿瘤边界中意义尤为重大。

2.6 皮肤附属器疾病 Aghassi等[24]对10例皮脂腺增生患者的29处损害使用585 nm脉冲染料激光治疗.用RCM观察了治疗前后及随访2，4，8周的图像，结果发现损害完全消失者占28%，损害直径减少者占66%，变平者占93%。Propperova等[25]通过研究发现皮脂腺RCM下表现为真皮内的桑葚样结构。Rudnicka等[26]对2例健康对照及6例患有毛发疾患的患者进行分析，可以观察毛囊口、毛干的情况，并可以观察单位面积内毛囊的数量，有助于毛发疾病的诊断及治疗效果的评价。Liu等[27]报告了胶样粟丘疹的RCM图像特点：真皮内可见低折光的分割区域。

2.7 Mohs显微外科 Mohs手术通过每次的切除进行快速冰冻切片检查，能将对周围正常组织的损伤降到最小。RCM作为非创伤性检查可以观察某些需要Mohs显微外科手术治疗的疾病的损害边界，以确定手术范围，特别对恶性黑素瘤、基底细胞癌及一些很难诊断的疾病。如无黑素的黑素瘤、硬化性浸润性基癌等。这种技术可以明确定位，彻底切除肿瘤，促进了Mohs显微外科发展。

综上所述RCM作为一项新发展的技术，其非侵入性检查特点在皮肤科领域将有广阔的应用前景，RCM正被广泛地认识和应用，相信随着这一技术不断完善和发展，必将促进对某些难治性皮肤病病因、发病机制的研究，为诊断和治疗提供新的有效的方法，推动皮肤科学发展。

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