糖尿病皮肤溃疡创面修复机制的研究进展

肖青青，王一飞，李欣，李福伦，李斌

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437）

创伤所导致的慢性皮肤溃疡是糖尿病患者住院的原因之一，其病情复杂易反复，可导致严重的并发症，治疗相对棘手，治疗方法局限，且发病率逐年上升，是目前临床急于攻克的难题。已知创面愈合是一个复杂而精细的过程，由多种细胞和分子参与。因此，了解糖尿病创面愈合的机制，对于找到具有针对性的治疗方法有着现实意义。目前研究显示已有超过数百个生理因素与糖尿病创面愈合不良有关，如生长因子降低、血管新生减少、巨噬细胞数目不多及功能受损、胶原沉积异常、角质细胞和成纤维细胞增殖减弱等[1]。本文将近年国内外研究的糖尿病创面愈合影响因素及相关机制做一分类性小结。

1 相关机制的研究

1.1 分子水平 研究表明，糖尿病皮肤组织在未受到外源性创伤的情况下已存在细胞、细胞外基质及生长因子等的病理改变，各因素互相关联，有学者[2-4]研究认为，局部皮肤高糖、氧化应激导致了局部炎症反应加剧，是糖尿病皮肤溃疡易发生的重要原因。角质形成细胞生成的白细胞介素8（IL-8）在创面愈合过程中负责招募中性粒细胞，而减少中性粒细胞浸润则有助于创面愈合。Lan等[5]假设增加中性粒细胞的招募可导致糖尿病创面愈合延迟，并使用体外培养的人角质形成细胞和糖尿病大鼠模型进行研究，结果表明，高糖环境中角质形成细胞通过表皮生长因子受体（EGFR）的胞外信号调节活性氧（ROS）依赖性激酶（ERK）通路来增加IL-8，糖尿病鼠的表皮生长因子受体，ERK和IL-8都有着明显的高表达且真皮创面分泌物中的中性粒细胞显著增高，若以氨苯砜（已知的可抑制中性粒细胞）干预糖尿病大鼠发现可改善其愈合。因此，在高糖环境中由于ROS水平升高，IL-8的产生及随之而来的中性粒细胞浸润增加等因素减慢了糖尿病创面愈合。作者认为针对这些功能障碍，可能会出现新的治疗方法。抑瘤素M（Oncostatin M，OSM）是一种多功能细胞因子，可导致大量的胶原沉积，目前的研究表明其也是纤维母细胞的分裂素且具有抗炎作用。Shin等[6]的体外研究发现，OSM通过作用于纤维母细胞而促进糖尿病患者创面的愈合，并进行了OSM对糖尿病创面愈合的作用的评价。研究中使用5只糖尿病小鼠。每一个小鼠的背面上创建四个圆形创面。2个左侧的创面上施加OSM，右侧的创面用磷酸盐缓冲盐水对照。10 d之后发现OSM治疗组与对照组比较在创面愈合速度及面积减少上都有更好的表现，差异有统计学意义，故OSM可以加速糖尿病创面愈合。Ansurudeen等[7]以2型糖尿病小鼠模型研究了肌肽的作用。创面组织分析显示肌肽可增加生长因子和细胞因子基因的表达，从而显著促进糖尿病创面的愈合。除了已知的其作为抗氧化剂和组胺合成前体的作用外，这项研究为肌肽可能促进糖尿病创面愈合提供了一种治疗证据。休克蛋白（Heat shock protein，HSP）广泛存在于原核和真核生物中，是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一。热休克蛋白90不仅对应激状态下的细胞提供保护作用,还参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激酶活性的调节[8]。近年来研究表明，热休克蛋白90可以作用于肿瘤细胞的抗凋亡途径，在细胞的抗凋亡反应中起着举足轻重的调控作用[9-10]。为了证明新的创面愈合的靶点，Cheng等[11]研究了来自人角化细胞中的热休克蛋白90α（Heat shock protein 90α，Hsp90α），转化生长因子 α（TGFα）通过在细胞内的非传统外切体通路引起快速膜移位和随后的Hsp90α分泌，分泌的Hsp90α通过表面受体低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）促进表皮和真皮细胞的迁移，而中和Hsp90的细胞外功能会阻碍这种迁移，因此，Hsp90α可能是一个潜在的创面愈合因子。糖尿病患者的创面愈合与异常的基质细胞衍生因子-1α （Stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）的生成有关。Bermudez等[12]发现 SDF-1α的高表达可以促进慢病毒介导的血管新生和糖尿病创面的愈合。故假设SDF-1α是创面可以正常修复的关键点而抑制其则会使创面修复的过程后滞。结果发现抑制SDF-1α会导致糖尿病创面愈合的速度明显减慢（对照组3.8 cm、实验组6.5 cm，P=0.04），同时也损害了非糖尿病创面的早期愈合阶段。因此得出SDF-1α的水平在创面愈合过程中起着关键作用的结论。

1.2 细胞水平 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，临床应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等，因其具有多向分化潜能、造血支持和免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注[13-16]。Kuo等[17]研究了骨髓来源的间充质干细胞在链脲佐菌素诱导的增强型糖尿病大鼠模型创面愈合中的作用，结果显示与对照组相比较，间充质干细胞治疗组的小鼠创面面积显著减小，且创面完全愈合时间短于对照组，比较差异有统计学意义[（6.6±1.13）周vs（9.8±0.75）周]，P＜0.001）。组织学分析显示，与对照组相比，间充质干细胞组的局部促炎反应减弱，CD45的表达也有着明显的抑制。免疫组织化学分析指出，治疗组的表皮生长因子、血管内皮生长因子、脯氨酰4-羟化酶的表达与对照组相比显著增加（P＜0.05）。因此，骨髓间充质干细胞可显著增强糖尿病创面愈合，这为临床寻找有效的治疗方法提供了新的思路。人脐血源性内皮祖细胞（EPCs）因可促进新生血管形成常应用于各种缺血性疾病的治疗。但是，其在糖尿病创面愈合中起到的积极作用及相关机制却鲜有报道。Kim等[18]以链脲佐菌素诱导的糖尿病的裸鼠为模型进行了相关研究，发现EPCs移植组的糖尿病创面中的角质形成细胞和成纤维细胞的增殖比PBS对照组早3 d，从而显著加速了创面闭合，RT-PCR分析表明，在EPCs注入的真皮组织中，角质细胞生长因子、血小板衍生生长因子出现高表达。这些结果表明，内皮祖细胞移植对促进糖尿病创面的愈合有积极影响，且主要是通过刺激分泌角质细胞，成纤维细胞和血管内皮细胞而发挥作用。

1.3 基因水平 p53基因作为重要的肿瘤细胞抑制因子之一，像所有其他肿瘤抑制因子一样在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用[19]。最近有研究发现p53基因在糖尿病创面中上调且影响着血管通路的形成。Nguyen等[20]假设沉默的p53可以促进糖尿病创面愈合及促血管生成因子的产生，结果发现与p53基因敲除组与正常对照组小鼠创面愈合时间分别为（18.0±1.3）d和（28.0±1.0）d。实验第10天，敲除组创面的血管内皮生长因子与对照组相比分泌显著增加，分别是（109.3±13.9）mg/L和（33.0±3.8）mg/L，且敲除组基质细胞衍生因子1-α的表达是对照组的1.86倍。故p53基因的特性也许为局部基因治疗糖尿病溃疡提供了新思路。基因遗传学影响着细胞的合成和生长因子在创面部位的传达，而这对于糖尿病溃疡的治疗将是不可忽视的治疗策略。有研究发现可能与micro RNA（miRNA）的表达有关，Madhyastha等[21]的研究报道了对于细胞发育与变异相关的miRNA在糖尿病小鼠创面愈合中的不同表达。与正常小鼠皮肤组织相比，共有14个miRNA在糖尿病皮肤中表达不同，而以微RNA-21（miR-21）的最为明显。miR-21在糖尿病患者皮肤中有明显的信号表达，但在糖尿病创面愈合过程中的表达减少。由于成纤维细胞在创面中的迁移是促进生长因子的分泌和其他类型相关细胞的进入创面的重要指标，故作者使用增益和损耗的函数方法，分析了miR-21在成纤维细胞中所扮演的角色，结果证明了miR-21参与成纤维细胞的迁移并初步得出了miRNA在糖尿病创面愈合机制中起到了重要作用这一结论。XU等[22]假设异常的miRNA-146a表达可能会导致慢性炎症并研究了miRNA-146a的靶基因在糖尿病和非糖尿病小鼠造成损伤后的表达。结果发现，miR-146a在糖尿病小鼠创面的表达明显下调。降低miR-146a的含量会使促炎细胞靶基因表达增高。此外，校正及给予糖尿病患者治疗后会使miR-146a的表达水平增加并降低其促炎的靶基因的基因表达。这些研究结果首次提供证据表明，减少糖尿病创面miR-146a的表达，可导致糖尿病创面异常炎症反应从而导致创面愈合障碍。

2 其他影响因素

王明勇等[23]观察了乳猪肝脏提取物对糖尿病创面的影响，结果发现，伤后第3，7，14天乳猪肝脏提取物组创面愈合速度比糖尿病对照组明显加快（P＜0.01），且创面愈合50%的时间较糖尿病对照组提前约4 d。创伤后14 d乳猪肝脏提取物组HE染色显示其成纤维细胞较丰富，毛细血管与创面垂直，肉芽组织趋于成熟，胶原致密，表皮增生并覆盖创面。故作者认为乳猪肝脏提取物对糖尿病创面愈合有显著的影响。赛佳明等[24]探讨了腺相关病毒（AAV）介导转化生长因子β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子（VEGF）联合转基因治疗促进糖尿病皮肤溃疡愈合的生物学效应，采用兔糖尿病动物模型，通过手术方法建立皮肤溃疡创面。将AAV2-TGF-β1和AAV2 VEGF联合转染糖尿病兔耳皮肤溃疡创面。通过皮TGF-β1和VEGF双重免疫组化染色、微循环血管密度显微镜观察计数、主胶原（Ⅰ、Ⅲ型胶原）提取及免疫印迹检测、胶原微量定量检测等方法进行研究，结果发现AAV2 TGF-β1和AAV2VEGF联合转基因治疗组与对照组相比TGF-β1和VEGF基因转录表达增多且创缘毛细血管叉密度（19.18±3.56）个/mm2高于对照组的（6.43±1.52）个/mm2，差别有统计学意义（P<0.05），联合转基因治疗组愈合组织中胶原含量均增多（P<0.05），而且Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成比中Ⅰ型胶原的比例增加。因此，作者认为AAV2 TGF-β1和AAV2 VEGF可联合高效转染糖尿病兔耳皮肤溃疡创面并有效地促进溃疡愈合。

3 总结与展望

创面的愈合是一个多细胞、多分子参与的复杂过程，各个过程相互交织，分子、细胞之间相互影响、相互制约。越来越多的中外的相关研究从不同层次不同方面来寻找并证实各种可能的影响其愈合过程的作用因素，随着这些因素的被发现，以细胞、分子基因等为基础的治疗方法也应运而生，虽然生长因子疗法目前多被临床采用，但理想的生长因子治疗方法正在探究，生长因子临床应用的安全性、耐受性以及最佳用药浓度、用药时间等问题有待解决。以间充质干细胞为主的细胞治疗方法及相关基因疗法可以显著促进创面愈合，但是尚处于实验阶段，其可靠性还需要进一步证实。且目前现有的治疗方法多为单分子单靶点的治疗，因此其治疗效果有限，若采用联合用药以及多靶点的治疗方法，则可能更有助于有效地解决其治疗现状。而进一步寻找确切的影响糖尿病创面愈合的相关因素对于指导临床的治疗有着相当重要的意义，也许随着其影响因子不断的被发现及相关机制的深入研究，将更多有效的治疗方法应用于临床，使糖尿病溃疡这一难题得以尽快解决。

[1]Brem H,Tomic-Canic M.Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes[J].J Clin Invest,2007,117:1219-1222.

[2]Park NY,Lim Y.Short term supplementation of dietary antioxidants selectively regulates the inflammatory responses during early cutaneous wound healing in diabetic mice[J].Nutr Metab(Lond),2011,8:80.

[3]Park NY,Park SK,Lim Y.Long-term dietary antioxidantcocktail supplementation effectively reduces renal inflammation in diabetic mice[J].Br J Nutr,2011,106:1514-1521.

[4]Meydani M,Lipman RD,Han SN,et al.The effect of long-term dietary supplementation with antioxidants[J].Ann N Y Acad Sci,1998,854:352-360.

[5]Lan CC,Wu CS,Huang SM,et al.High-glucose environment enhanced oxidative stress and increased interleukin-8 secretion from keratinocytes:new insights into impaired diabetic wound healing[J].Diabetes,2013,62:2530-2538.

[6]Shin SH,Han SK,Jeong SH,et al.Potential of Oncostatin M to accelerate diabetic wound healing[J].Int Wound J,2012,11:233-238.

[7]Ansurudeen I,Sunkari VG,Grünler J,et al.Carnosine enhances diabetic wound healing in the db/db mouse model of type 2 diabetes[J].Amino Acids,2012,43:127-134.

[8]Barginear MF,Van Poznak C,Rosen N,et al.The heat shock protein 90 chaperone complex:an evolving ther apeutic target[J].Curr Cancer Drug Targets,2008,8:522-532.

[9]Whitesell L,Lindquist SL.HSP90 and the chaperoning of cancer[J].Nat Rev Cancer,2005,5:761-772.

[10]Garrido C,Gurbuxani S,Ravagnan L,et al.Heat shock proteins:endogenous modulators of apoptotic cell death[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,286:433-442.

[11]Cheng CF,Fan J,Fedesco M,et al.Transforming growth factor alpha(TGFalpha)-stimulated secretion of HSP90alpha:using the receptor LRP-1/CD91 to promote human skin cell migration against a TGFbeta-rich environment during wound healing[J].Mol Cell Biol,2008,28:3344-3358.

[12]Bermudez DM,Xu J,Herdrich BJ,et al.Inhibition of stromal cellderived factor-1α further impairs diabetic wound healing[J].J Vasc surg,2011,53:774-784.

[13]Yen BL,Huang HI,Chien CC,et al.Isolation of multipotent cells from human term placenta[J].Stem Cells,2005,23:3-9.

[14]Romanov YA,Svintsitskaya VA,Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord[J].Stem Cells,2003,21:105-110.

[15]In't Anker PS,Scherjon SA,Kleijburg-van der Keur C,et al.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta[J].Stem Cells,2004,22:1338-1345.

[16]Kuznetsov SA,Mankani MH,Gronthos S.Evidence for circulating osteogenic progenitos in humans and other mammals[J].Bone,1998,23:211.

[17]Kuo YR,Wang CT,Cheng JT,et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells enhanced diabetic wound healing through recruitment of tissue regeneration in a rat model streptozotocin induced diabetes[J].Plast Reconstr Surg,2011,128:872-880.

[18]Kim JY,Song SH,Kim KL,et al.Human cord blood-derived endothelial progenitor cells and their conditioned media exhibit therapeutic equivalence for diabetic wound healing[J].Cell Transplant,2010,19:1635-1744.

[19]Lane DP,Crawford LV.T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells[J].Nature,1979,278:261-263.

[20]Nguyen PD,Tutela JP,Thanik VD,et al.Improved diabetic wound healing through topical silencing of p53 is associated with augmented vasculogenic mediators[J].Wound Repair Regen,2010,18:553-559.

[21]Madhyastha R,Madhyastha H,Nakajima Y.MicroRNA signature in diabetic wound healing:promotive role of miR-21 in fibroblast migration[J].Int Wound J,2012,9:355-361.

[22]Xu J,Wu W,Zhang L,et al.The role of microRNA-146a in the pathogenesis of the diabetic wound-healing impairment:correction with mesenchymal stem cell treatment[J].Diabetes,2012,61:2906-2912.

[23]王明勇,黄华英,孙晓磊,等.乳猪提取物对糖尿病大鼠创面的影响[J].中国医药导报,2012,14（11）:1966-1968.

[24]赛佳明,张慧琴.腺相关病毒分别介导转化生长因子β1和血管内皮生长因子联合转染促进糖尿病皮肤溃疡愈合的生物学效应[J].创伤外科杂志,2007,9（5）:450-454.