勐库大叶茶中总黄酮最佳提取工艺的研究

周银丽+白建波+邓玉华+黄继文+王朝光+张虹

摘 要：黄酮类化合物具有多种药理作用，勐库大叶茶中含有丰富的黄酮类物质。本试验采用乙醇恒温浸提的方法提取勐库大叶茶中的总黄酮，并结合正交试验选择出最佳的提取工艺条件。结果表明4因素对勐库大叶茶中总黄酮提取得率影响的主次顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间，最佳提取工艺条件为乙醇浓度70 %、料液比1g：30 mL、提取温度85 ℃、提取时间2.0 h，在此条件下总黄酮的提取率为2.096 %。

关键词：勐库大叶茶 总黄酮 正交试验 最佳工艺

我国茶叶主要产地为云南、安徽、福建、湖南、浙江等地[1 ]，云南茶树树高叶大，茶味浓厚，习惯上都称之为“云南大叶种”，云南全省120个产茶县中有大叶茶分布的近100个县[2 ]。双江是云南主要产茶县之一，全县辖勐库等2个镇及5个乡，年产茶2210 t，该县北部的勐库镇是国家级有性系茶树良种勐库大叶茶的原产地。勐库大叶茶树势遒劲、芽叶肥壮、品质超群，受到人们的喜爱[3，4 ]。

茶叶中含有丰富的黄酮，Hodgson的研究表明，经常饮茶增加黄酮类物质摄入量能降低患心血管疾病的风险[5 ]；Grassi利用动物模型研究表明饮食结构中的类黄酮物质能延迟动脉粥样硬化斑块的发展[6 ]；Koutelidakis的研究表明，绿茶，白茶具有抗氧化效果，这种效果不仅在血浆中可以观察到活性，在其他器官中同样存在[4 ]；Wang的研究表明，喝红茶和绿茶的防病效果不同，喝绿茶能减少患冠状动脉疾病的危险[8 ]；Arts则研究了茶摄入量和肺癌的关系，该研究在不吸烟者和曾经吸烟者间展开，以消除吸烟的干扰效应，7个实验中有4个证明饮茶对预防肺癌有显著的作用[9 ]。黄酮类化合物还具有抗肿瘤、抗炎镇痛、免疫调节、抑菌抗病毒、抗辐射等多种药理作用[10 ]。本文主要研究勐库大叶茶中总黄酮的含量以及使用乙醇恒温浸提提取勐库大叶茶中总黄酮的最佳工艺条件，为今后勐库大叶茶的进一步开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：勐库大叶茶（干茶）；仪器：722S紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）、电子天平、恒温水浴锅、高速离心机等；试剂：芦丁、无水乙醇、三氯化铝、三氯化铁、浓氨水、盐酸、镁粉、5 %亚硝酸钠、10 %硝酸铝等。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮的提取

首先把500 g勐库大叶茶干茶进行粉碎，分别称取5 g碎茶叶，加入浓度为65 %、70 %、75 %的乙醇，封口置于温度为75 ℃、80 ℃、85 ℃的恒温水浴锅一定时间（2 h、3 h、4 h），然后取出离心过滤。洗涤残渣，定容至50 mL容量瓶中，作为待测液备用（该待测液即为含茶叶总黄酮的溶液）。

1.2.2 黄酮的鉴定

对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如下。

盐酸—镁粉反应：取1.0 mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（1次加入），观察其泡沫颜色；

三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1 %三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察颜色变化；

三氯化铁反应：取几滴提取液于滤纸上，滴加1 %三氯化铁乙醇溶液，观察其颜色；

氨显色反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5 min，观察其颜色变化。

1.2.3 测定方法及其依据

以芸香苷为对照品测定茶叶中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适当的pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得特定的吸收峰。

1.2.4 定量实验-总黄酮的含量测定

1.2.4.1 波长的选择

取适量的样品液，在0.30 mL5 %亚硝酸钠溶液的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液，在420～700 nm波长范围测定螯合物的吸光度，螯合物在510 nm处有最大吸收，故测定时选用510 nm的波长。

1.2.4.2 标准曲线的绘制

首先进行标准溶液的制备：精密称取120 ℃恒温干燥至恒重的芸香苷20 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60 %乙醇溶液并稀释至刻度，摇匀即得0.2 mg/mL的标准品溶液。然后进行标准曲线的制备：精密吸取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL分置于25 mL容量瓶中，分别加5 %亚硝酸钠和10 %硝酸铝溶液各4.0 mL，用30 %的乙醇稀释至刻度，混匀，放置16 min。然后用722S 紫外可见分光光度计在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，由此可得回归方程D=11.133C-0.0134，r2 =0.9989，r=0.999，n=7。

1.2.5 乙醇恒温浸提正交试验设计

为了确定乙醇恒温浸提提取勐库大叶茶中总黄酮最佳提取工艺条件，利用正交实验法进行试验。选用乙醇浓度、提取温度、提取时间及固液比4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）正交表进行实验设计优化[11 ]。

2 结果与分析

2.1 黄酮鉴定结果分析

盐酸-镁粉反应呈紫红色；三氯化铝反应在可见光下呈灰蓝色；三氯化铁反应呈紫色；氨显色反应在紫外光下呈极明显的墨绿色荧光斑点，由表1的结果可证明待测液中含有黄酮类化合物。

2.2 乙醇恒温浸提勐库大叶茶中总黄酮正交实验结果分析

对正交试验结果的数据进行极差分析见表2，乙醇浓度的极差（0.429）大于固液比的极差（0.277），而且远大于提取温度极差（0.164）和提取时间的极差（0.095），4个因素对茶叶中黄酮提取得率影响的主次顺序为A>D>B>C，即乙醇浓度和固液比对提取得率的影响最大，提取温度与提取时间对黄酮提取率的影响较小。最佳提取条件为A2B3C1D2，即乙醇浓度为70 %，固液比（g/mL）为1：30，提取温度为85 ℃，提取时间为2 h时勐库大叶茶茶叶黄酮得率最高，为2.096 %。

3 结论

试验采用乙醇恒温浸提的方法提取勐库大叶茶中的总黄酮，并且通过正交试验分析了影响黄酮提取率的4个因素。这4个因素对勐库大叶茶中总黄酮提取得率的影响顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间。综合各因素分析及考虑时间和资源耗用的情况，乙醇恒温浸提提取勐库大叶茶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取温度85 ℃、提取时间2 h。最佳方案提取得率为2.096 %。

4 讨论

试验提取勐库大叶茶中的总黄酮得率为2.096 %，与姚小敏等用其他茶叶为材料提取黄酮的黄酮得率2.19 %十分接近[11 ]。最佳提取条件为乙醇浓度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取温度85 ℃、提取时间2 h，4因素对茶叶提取得率影响的主次顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间，与王在贵等的研究结论相比也十分接近[12 ]。试验结果表明勐库大叶茶中含有较高的黄酮类化合物，有较高的饮用价值，可为勐库大叶茶的进一步开发利用提供参考。

参考文献

[1] 安徽农学院. 制茶学（第二版）[M]. 北京：中国农业出版社，1986：1-5.

[2] 虞富莲. “云大”真宗-勐库大叶茶[J]. 茶叶，1985（2）：11-12.

[3] 张俊，王平盛，陈红伟，等. 云南双江勐库野生古茶树群落[J]. 茶叶，2003，29（4）：220-221.

[4] 杨忠兴，俸忠华，张朝荣，等. 双江勐库野生古茶树群落威胁因子及保护思路[J].中国茶叶，2010（3）：4-6，9.

[5] Hodgson，J. M. Tea flavonoids and cardiovascular disease[J]. Asia Pac J Clin Nutr，2008，17（1）： 288-290.

[6] Grassi，D.，A. Aggio，et al. Tea，flavonoids，and nitric oxide-mediated vascular reactivity[J]. The Journal of nutrition，2008，138（8）：1554S-1560S.

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[9] Ilja C.W. Arts. A review of the epidemiological evidence on tea，flavonoids，and lung cancer[J]. The Journal of nutrition，2008， 138（8）： 1561S-1566S.

[10] 曹纬国，刘志琴，邵云，等. 黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23（12）：2241-2247.

[11] 姚小敏，覃成箭，羊金梅，等. 茶叶中总黄酮的提取、鉴别及其含量测定[J]. 右江民族医学院学报，2005，27（6）：779-781.

[12] 王在贵，王磊，高丽萍，等. 茶叶总黄酮的提取工艺研究[J]. 饲料工业，2009，30（24）：42-44.

3 结论

试验采用乙醇恒温浸提的方法提取勐库大叶茶中的总黄酮，并且通过正交试验分析了影响黄酮提取率的4个因素。这4个因素对勐库大叶茶中总黄酮提取得率的影响顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间。综合各因素分析及考虑时间和资源耗用的情况，乙醇恒温浸提提取勐库大叶茶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取温度85 ℃、提取时间2 h。最佳方案提取得率为2.096 %。

4 讨论

试验提取勐库大叶茶中的总黄酮得率为2.096 %，与姚小敏等用其他茶叶为材料提取黄酮的黄酮得率2.19 %十分接近[11 ]。最佳提取条件为乙醇浓度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取温度85 ℃、提取时间2 h，4因素对茶叶提取得率影响的主次顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间，与王在贵等的研究结论相比也十分接近[12 ]。试验结果表明勐库大叶茶中含有较高的黄酮类化合物，有较高的饮用价值，可为勐库大叶茶的进一步开发利用提供参考。

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[12] 王在贵，王磊，高丽萍，等. 茶叶总黄酮的提取工艺研究[J]. 饲料工业，2009，30（24）：42-44.

3 结论

试验采用乙醇恒温浸提的方法提取勐库大叶茶中的总黄酮，并且通过正交试验分析了影响黄酮提取率的4个因素。这4个因素对勐库大叶茶中总黄酮提取得率的影响顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间。综合各因素分析及考虑时间和资源耗用的情况，乙醇恒温浸提提取勐库大叶茶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取温度85 ℃、提取时间2 h。最佳方案提取得率为2.096 %。

4 讨论

试验提取勐库大叶茶中的总黄酮得率为2.096 %，与姚小敏等用其他茶叶为材料提取黄酮的黄酮得率2.19 %十分接近[11 ]。最佳提取条件为乙醇浓度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取温度85 ℃、提取时间2 h，4因素对茶叶提取得率影响的主次顺序为乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间，与王在贵等的研究结论相比也十分接近[12 ]。试验结果表明勐库大叶茶中含有较高的黄酮类化合物，有较高的饮用价值，可为勐库大叶茶的进一步开发利用提供参考。

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