冠心病患者血液循环miR－126表达的临床意义研究

胡 旭，刘红霞

（河南省南阳市中心医院检验科 473001）

miRNA是一类小分子非编码单链RNA，长度只有18～24个核苷酸，通过与靶基因mRNA 3′－UTR区互补配对，在翻译水平调控基因的表达［1］。大量研究表明，miRNA与动脉粥样硬化、高血压、心肌肥厚等心血管疾病密切相关［2］。冠心病（coronary heart disease，CHD）是严重威胁人类健康的常见心血管疾病，其发病机制目前尚未明了，因此临床上也缺乏有效的防治手段，探寻CHD的发病机制一直是学者们努力研究的方向［3］。血液循环中miRNA的变化与心血管疾病发病中的作用近年来逐渐受到关注，并已有研究使用循环miRNA作为心血管疾病诊断及药物疗效评价的生物标志物［4］，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以参与到动脉粥样硬化病变中。本研究观察CHD患者血液循环中miR－126和VEGF的表达变化，探讨二者间相互调控关系及在CHD发生、进展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年12月至2013年2月本院诊治的CHD患者66例，其中男38例，女28例，年龄43～69岁，平均（54.8±10.2）岁。CHD诊断参照2007中华医学会心血管分会制定的诊断标准：冠状动脉造影检查确诊（至少有一主要分支冠状动脉狭窄大于或等于50%）。66例冠心病患者根据冠脉病变范围分为单支病变20例、双支病变24例、多支病变22例。另取本院同期健康体检者20例作为对照组，其中男12例，女8例，年龄44～70岁，平均（54.6±10.4）岁。各组在性别、年龄等一般临床资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 试剂和仪器 Trizol试剂购自TaKaRa公司；dNTPMix、Rnasin、M－MLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶及缓冲系统购自美国Promega公司；逆转录茎环引物、Has－miR－126茎环引物由上海生工生物科技有限公司合成；VEGF检测试剂盒购自深圳达科为生物技术有限公司。Real time－PCR仪为美国罗氏公司产品，全自动生化分析仪为日本日立（HICTHI－7080）公司产品。

1.3 miR－126表达的Real time－PCR检测 采集受试者静脉血2mL，3000r／min离心15min分离上清，取250μL用蛋白酶K于56℃水浴2h，加入Trizol按照试剂说明提取细胞总RNA，逆转录茎环引物和 M－MLV逆转录酶反转录，TaqDNA聚合酶、Has－miR－126茎环引物和SYBR Green荧光染料定量检测miR－126的表达量。Has－miR－126茎环引物序列为5′－TAT CCA GTG ATT CCG ACC GCC GCA TGG AGT CTG－3′（正义链）和5′－TCC GCT CTT GGT GTG GTG TGA GTC GC－3′（反义链），内参照使用GAPDH基因。反应条件：94℃2min；94℃30s，6℃30s，72℃30s35个循环；72℃5min。△Ct值＝ miR－126Ct值－GAPDH Ct值，miR－126的表达量使用2－△Ct评估。

1.4 VEGF表达的测定 采集受试者静脉血2mL，3000r／min离心15min分离上清待测。VEGF表达的测定使用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作，使用标准品绘制标准曲线，对照标准曲线计算VEGF的表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件处理数据，实验数据以表示，两样本均数比较先用方差分析，再采用t检验，Pearson相关性分析分析各检测指标的相关关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组miR－126和VEGF表达的变化 对照组miR－126表达量0.316±0.072显著高于CHD组0.227±0.053（P＜0.05），VEGF表达量（80.72±21.56）μg／mL显著低于 CHD组（131.18±32.25）μg／mL（P＜0.05）。相关性分析显示VEGF表达水平与miR－126表达呈显著负相关（r＝－0.562，P＜0.05）。相关性分析显示VEGF表达水平与miR－126表达呈显著负相关（r＝－0.562，P＜0.05）。

2.2 不同冠脉病变患者miR－126和VEGF的表达 不同冠脉病变患者miR－126和VEGF表达存在显著性差异（P＜0.05），miR－126表达随着冠脉病变分支的增加而逐渐减低（P＜0.05），而VEGF表达随着冠脉病变分支的增加而逐渐增加（P＜0.05）。见表1。

表1 CHD不同冠脉病变患者miR－126和VEGF表达的变化（）

表1 CHD不同冠脉病变患者miR－126和VEGF表达的变化（）

组别 n miR－126 VEGF（μg／mL）20 0.287±0.061 102.160±23.540双支病变组 24 0.236±0.057 132.450±33.160多支病变组单支病变组22 0.182±0.040 155.740±40.220

3 讨 论

近来的研究发现血液循环中存在大量的miRNA，并且血液循环中miRNA的表达谱会随着疾病状态的变化而变化，已有学者开始尝试检测血液循环中miRNA表达变化用于临床疾病的诊断［5－6］。本研究显示CHD患者外周血液循环中miR－126表达出现了显著的减低，并且其有随着冠脉病变分支的增加而逐渐减低的趋势，提示了miR－126表达的下调可能参与了冠脉病的发生、发展过程。miRNA进入血液循环目前有两种解释：一种是组织细胞损伤后释放入血，另一种是miRNA被一种50～100nm大小的微泡小颗粒包裹，这种小颗粒微泡可以逃脱血浆中高活性核糖核酸酶的酶解作用，起到细胞间传递、交流重要物质的作用［7］。

CHD是一种常见的老年性疾病，血管壁局部的脂质沉积导致的动脉粥样硬化是基本的病理改变，VEGF是特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子［8］。实验研究已证实，VEGF在动脉粥样硬化斑块的增殖和活化中起着重要作用［9］。本研究观察到CHD患者VEGF表达出现了显著的升高，VEGF可以增加血管通透性，并促进巨噬细胞和单核细胞迁移到动脉粥样硬化斑，借此在CHD的发生、发展中起着关键的作用［10］。VEGF表达会随着冠脉病变分支的增加而逐渐增加，提示了VEGF表达的上调可能参与了CHD的发生、发展过程。

相关性分析显示miR－126表达与VEGF表达水平呈显著负相关，提示了二者之间存在相互调控的关系，说明CHD患者中VEGF表达的升高可能是因为miR－126在转录后对VEGF的调节失调所致，具体的调控分子机制还有待进一步的研究。Ishizaki等［11］研究也显示miR－126联合Egfl7基因可以参与到VEGF的调节信号通路中。

综上所述，本研究显示CHD患者中存在miR－126的异常表达，下调的miR－126失去了对VEGF的抑制可能是其参与CHD发生、发展的主要作用机制，miR－126的检测可用于CHD病变的评估。

［1］Qiang L，Hong L，Ningfu W，et al.Expression of miR－126 and miR－508－5p in endothelial progenitor cells is associated with the prognosis of chronic heart failure patients［J］.Int J Cardiol，2013，168（3）：2082－2088.

［2］钟华，陆瑶，缪汝佳，等.微小RNA在内皮细胞参与的血管生成中的作用［J］.临床心血管病杂志，2013，29（9）：650－653.

［3］Huang J，Wu YF，Liu XQ，et al.Subclinical atherosclerosis in northern and southern China：the Chinese paradox［J］.J Geriatr Cardiol，2011，8（2）：72－77.

［4］Kampoli AM，Tousoulis D，Papageorgiou N，et al.Clinical utility of biomarkers in premature atherosclerosis［J］.Curr Med Chem，2012，19（16）：2521－2533.

［5］孙吉，陈小平.microRNA与心血管疾病的关系［J］.分子诊断与治疗杂志，2011，3（3）：192－199.

［6］Yu XY，Chen JY，Zheng ZW，et al.Plasma miR－126as a potential marker predicting major adverse cardiac events in dual antiplatelet－treated patients after percutaneous coronary intervention［J］.EuroIntervention，2013，9（5）：546－554.

［7］Sasahira T，Kurihara M，Bhawal UK，et al.Downregulation of miR－126induces angiogenesis and lymphangiogenesis by activation of VEGF－A in oral cancer［J］.Br J Cancer，2012，107（4）：700－706.

［8］杨汆，丁志坚，朱傲霜，等.冠心病患者血浆periostin蛋白与血管内皮生长因子的相关性［J］.中国动脉硬化杂志，2011，19（2）：135－138.

［9］Matsudaira K，Maeda K，Okumura N，et al.Impact of low levels of vascular endothelial growth factor after myocardial infarction on 6－month clinical outcome［J］.Circ J，2012，76（6）：1509－1516.

［10］马跃东，李德华.VEGF在心血管疾病治疗中作用的研究进展［J］.中国老年学杂志，2011，31（9）：1703－1705.

［11］Ishizaki T，Tamiya T，Taniguchi K，et al.miR126positively regulates mast cell proliferation and cytokine production through suppressing Spred1［J］.Genes Cells，2011，16（7）：803－814.