磁共振示踪法定量测量大鼠C6胶质瘤模型细胞外间隙扩散参数

左 龙，赵 越，李怀业,李 凯,卢嘉宾，韩鸿宾

(1. 北京大学第三医院放射科，北京 100191; 2.磁共振装备与技术北京市重点实验室, 北京 100191; 3.大连大学化学与化学工程学院，大连116622; 4.北京积水潭医院放射科，北京 100035)

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占恶性脑肿瘤的81%[1]。胶质瘤通常会导致显著的致残率和死亡率。在过去的几十年中，治疗方法不断改进。目前，放疗联合化疗是手术后的一线辅助治疗[2]。然而，几乎所有的胶质母细胞瘤患者在7～10个月无进展生存期中位期后都会出现病情进展[3]。因此，胶质母细胞瘤总体上难治且预后差。实际上大多数化疗药物不能通过血脑屏障，因而药物到达肿瘤靶点的效率低下[4]。研究人员相继发明了诸多新的治疗策略，其中局部给药可以直接绕过血脑屏障。局部给药具体包括，局部注射、对流增强给药和各种埋置多聚物。局部给药可以将高生物利用度的制剂直接作用于靶点，而且几乎没有药物损耗[5]。然而，溶液回流和水肿等多种副作用阻碍了对流增强给药(CED)发展成一个用于神经胶质瘤的标准治疗系统[6].

为克服上述缺陷，人们建立了一种磁共振实时成像的方法来监测给药过程[7-9]，但却没有定量计算局部扩散和清除参数。本课题组首先应用磁共振示踪技术定量测量了正常大鼠脑尾状核、丘脑、枕叶皮质和黑质的扩散和清除参数[10，11]。本研究首次应用磁共振示踪技术定量比较了C6胶质瘤10 d模型和20 d模型扩散和清除参数的差异，并且对影响扩散和清除的细胞外基质成分进行了免疫组化和蛋白质印迹分析比较。

1 材料和方法

1.1 溶液制备和实验动物

用双蒸水稀释钆二乙三胺五乙酸 (Gd-DTPA，马根维显，拜耳先灵制药，德国) 至10 mmol/L。本研究方案获得了北京大学医学部动物伦理委员会的批准(批号 No. LA2012-016)。16 只成年雄性 SD 大鼠，清洁级，体重(250～300)g，北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物生产许可证号 SCXK( 京) 2011-0012。实验动物使用许可证号：SYXK(字)2011-0039。随机分为两组： 10 d胶质瘤组(n=8)和20 d胶质瘤组(n=8)。C6大鼠胶质瘤细胞系(ATCC No. CCL 107) 培养如以往报道。大鼠(n=8)经腹膜内注射戊巴比妥钠、乙醇、水合氯醛、硫酸镁和丙二醇混合物(3 mL/kg)麻醉后，固定于立体定位仪(Stoelting, 美国)。在头皮沿矢状缝从两耳间区域至两眼间区域做正中切口，小心分离脑膜暴露前囟。右侧颅骨表面定位钻孔 (前囟前，1 mm；右旁开，3.5 mm)。C6细胞悬液(5 ×106cells in 10 μL)经颅骨孔缓慢注入(10 min)右侧尾状核 (前囟前，1 mm；右旁开，3.5 mm；深，5.0 mm)。微量进样器停针5 min。颅骨孔用骨蜡封闭，头皮缝合。

1.2 MRI示踪法示踪大鼠C6胶质瘤模型细胞外间隙扩散

大鼠麻醉如前所述，实验过程中适时追加保持麻醉状态(约为 0.7 mL/kg/h)。大鼠置于加热垫(38 ± 0.5)°C上保持体温。预扫描将大鼠置于西门子磁共振成像(Magnetom Trio，Germany)系统腕线圈中, 用 T1 加权三维磁化准备快速采集梯度回波序列(T1 3D MP-RAGE)扫描[12]。获得用于图像后处理的预扫描图像并用于确定穿刺位点。大鼠颅顶备皮，碘伏消毒。沿矢状缝从两耳间区域至两眼间区域开头皮，小心分离脑膜暴露前囟。将大鼠置于立体定位仪上, 根据 MRI 预扫描结果显示的肿瘤生长情况在颅骨表面重新定位钻孔，向肿瘤中心区域微量注射10 mmol/L Gd-DTPA 溶液 2 μL(注射时间 10 min)。注射 Gd-DTPA 后不同时间点,15min、30 min、第1、2、3、4、5、6小时行磁共振扫描成像。成像序列和参数如前所述。

1.3 图像后处理和参数计算

用 MATLAB7.8 软件(MathWork, 美国)将注射后扫描图像与预扫描图像配准后获得减影图像[13]。本课题组前期研究中，已经发现了3.0T磁共振机应用T1加权3D MP-RAGE序列扫描的Gd-DTPA浓度与信号强度增量(ΔSI)的线性关系[12]。与以往的1/T1值与Gd-DTPA浓度关系相比更有利于实时成像计算[14-16]。MRI示踪法定量细胞外间隙扩散的主要参数包括自由扩散系数 (D)，有效扩散系数(D*)，迂曲度 (λ)和清除速率常数(k’). 根据本课题组已经报道的方法进行参数计算[17]。为测量脑组织间液流动参数半衰期(thalf-life)，将高于背景噪音两个标准差的的信号强度作为阈值，逐层提取感兴趣区内的所有像素得到各扫描时间点Gd-DTPA总量(Gdsum)。由于Gd-DTPA在脑内按一级动力学常数清除，Gd-DTPA的半衰期可以通过曲线拟合得到(Gdsum=e-kt)，其中半衰期(thalf-life)根据thalf-life=ln(2/k)进行计算。

1.4 免疫组化

选取典型的细胞外基质大分子进行免疫组化分析[18-20]。5 μm石蜡切片脱蜡后，3%过氧化氢避光浸泡，抗原热修复。分别滴加抗硫酸软骨素蛋白多糖、腱生蛋白C、IV型胶原蛋白一抗(兔抗大鼠；1∶200；博奥森)，4℃过夜；加二抗常温孵育30 min。DAB显色，苏木素复染细胞核。

1.5 蛋白质印迹(Western blotting)

将上述大分子用蛋白质印迹法进行检测[21-23]。肿瘤组织取材，加入裂解液匀浆后离心，各取上清液50 μg点样于12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜，用5%脱脂牛奶封闭。分别用硫酸软骨素蛋白多糖抗体、腱生蛋白C抗体、抗IV型胶原蛋白(兔抗大鼠；1∶1 000；博奥森)或抗GAPDH(1∶10 000; 博奥森) 4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，洗膜后加入免疫印迹化学发光检测试剂( enhanced chemiluminescence，ECL)，X光胶片曝光，ImageJ软件(国立卫生院，美国)分析。以GAPDH蛋白作为系统内参，测定条带进行灰度值，以目的/内参比值来比较表达的差异。

1.6 统计学方法

统计分析采用SPSS软件19.0版本进行 (IBM，美国)。所有结果均用均值±标准差(SD)的形式表示。用独立样本t检验比较两组样本的有效扩散系数(D*)，迂曲度(λ)，清除速率常数(k’)和半衰期(thalf-life)。用配对样本t检验比较两组样本的蛋白印迹分析。P值小于0.05(P<0.05)为有统计学差异。

2 结果

2.1 胶质瘤10d模型和胶质瘤20 d模型Gd-DTPA扩散参数和半衰期的比较

MRI矢状位、横轴位和冠状位三个方向显示不同时间点Gd-DTPA的扩散过程(图1和2); Gd-DTPA导入细胞外间隙后，局部信号强度增高，随后信号强度随时间衰减至示踪剂从细胞外间隙中清除。20 d胶质瘤有效扩散系数(D*)明显小于10 d胶质瘤((6.67±1.78) ×10-5mm2/s vs. (1.26±0.27) ×10-4mm2/s; t=4.265;P<0.01)，导致迂曲度(λ)增大 (λ=(D/D*)1/2)((3.99±0.57) vs. (2.83±0.29);t=4.11;P<0.01) (图3A)。测量清除速率常数(k’)，20 d胶质瘤((7.67±2.29) ×10-5mm2/s) 小于10 d胶质瘤 ((1.46±0.36) ×10-4mm2/s)，差异有统计学意义(t=3.87;P<0.05)(图3A)。10d胶质瘤半衰期(0.86±0.23 h)显著小于20 d胶质瘤(1.64±0.12 h) (t=5.91;P<0.01)(图3B)。

注1：(A)矢状位；(B)横轴位；(C)冠状位

注2：(A)矢状位；(B)横轴位；(C)冠状位。

2.2 胶质瘤10 d模型和20 d模型细胞外基质表达的差异

注3：(A)扩散参数定量分析(D*,λ,k’) (B)Gd-DTPA的半衰期拟合曲线图。(C)胶质瘤10 d模型半衰期与胶质瘤20 d模型半衰期统计分析(thalf-life)，** P<0.01。

为了更好地理解上述扩散参数(D*, λ 和k’)和半衰期(thalf-life)的差异，我们用免疫组化法观察到20 d胶质瘤中硫酸软骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型胶原蛋白的表达(图4B, 4D和4F)均较10 d胶质瘤的表达(图 4A, 4C和4E，图4见封三)增高。Western blotting的定量结果进一步证实了这些发现。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs/GAPDH)(图 5A)在20 d胶质瘤中(0.48±0.07)的表达均高于在10 d胶质瘤中(0.32±0.09)的表达(t=4.663；P<0.01)，腱生蛋白C(Tenascin-C/GAPDH)亦然((0.29±0.04)vs.(0.58±0.11)；t=6.50;P<0.01)(图5B)。20 d胶质瘤中IV型胶原蛋白(collagen IV/GAPDH)(图5C)的含量也高于10 d胶质瘤((0.24±0.07)vs.(0.33±0.06)；t=3.81；P<0.05)。

3 讨论

众所周知，磁共振扩散加权成像(diffusion-weighted MRI)是一种能够测量组织内水分子扩散的成像技术，是脑肿瘤分级和判断放化疗疗效方面的研究热点[24-27]。但是由于扩散加权成像并不能区分细胞内和细胞外的扩散且空间分辨力低，因而难以用于指导脑内局部给药[28]，实时磁共振示踪技术应运而生。

本研究应用磁共振示踪法定量研究了胶质瘤模型在生长的第10天和第20天肿瘤细胞外间隙的有效扩散系数(D*)，清除速率常数(k’)和半衰期(thalf-life)等方面表现出了显著的差异。这两个时期的胶质瘤细胞外扩散和清除的所具有的不同特征与胶质瘤细胞外基质的不同相关。20 d胶质瘤细胞外基质成分如硫酸软骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型胶原蛋白的增多，与20 d胶质瘤有效扩散系数、清除速率常数的较小和半衰期的延长相对应。

注5：(A) 硫酸软骨素蛋白多糖Western blot分析；(B) 腱生蛋白C Western blot分析；(C) IV型胶原蛋白Westernblot分析；** P<0.01,* P<0.05.

通常，肿瘤体积的增大是肿瘤进展的重要标志[29]。肿瘤细胞植入后，肿瘤体积随时间逐渐增大，即为肿瘤进展[30]。肿瘤细胞外间隙的扩散对于肿瘤细胞摄取营养物质，和抗肿瘤药物到达治疗靶点作用于肿瘤都至关重要[31]。细胞外基质成分是影响脑肿瘤细胞外间隙扩散的重要因素之一[32， 33]，可以增加细胞外间隙粘滞度，降低扩散速率[34]。细胞外基质的存在增加了分子运动的粘滞阻力，使细胞外间隙不再是自由扩散介质[35]。以往文献报道，硫酸软骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型胶原蛋白在胶质瘤细胞外间隙中高表达，并随着肿瘤生长进展含量逐渐升高[22， 36-40]。本研究的结果与以往文献报道一致。脑细胞外间隙占脑容积的20%，脑细胞间约50 nm的空隙内含细胞外基质[41， 42]。目前认为细胞外基质成分可降低溶质分子或膜相关分子的扩散[34]。胶质瘤细胞外基质分子种类较多，主要包括蛋白多糖、糖蛋白、胶原纤维等成分[43]。本研究中的硫酸软骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型胶原蛋白分别是上述三种主要成分的典型代表分子，在ECS中含量较高，参与构成胶质瘤细胞生长的微环境，并影响胶质瘤细胞的进展转移等生物学行为，而受到广泛关注[36]。另外由于几种成分之间往往相互连接构成复合结构[43]，所以选取典型细胞外基质分子有助于对于胶质瘤细胞外间隙的分析。本研究局限性在于只是选取了典型的细胞外基质分子，未来需要对于细胞外基质的各种分子对扩散的影响进行更全面的研究，并进一步对不同类型胶质瘤扩散参数和细胞外基质的表达进行定量研究。

肿瘤分期是肿瘤学研究的基本内容之一。国际抗癌联盟 (UICC) 美国癌症联合会(AJCC) 的TNM分期系统[44]是五十多年来评估肿瘤患者预后的参考[45]。但是自第五版以来，TNM分期已不再包含原发性脑肿瘤的内容[44]。目前使用的是世界卫生组织(WHO)分类标准，将原发性脑肿瘤分为星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤和混合型胶质瘤[46]。有学者认为将肿瘤体积、浸润情况和淋巴结转移等考虑在内可将肿瘤进一步分期[47]，并认为T分期(肿瘤大小)是制定各期神经胶质瘤治疗方案的重要参考[48]。在我们的研究中发现两个时期的胶质瘤扩散参数明显不同，提示局部给药参数应根据肿瘤进展情况进行调整。

局部给药是治疗恶性胶质瘤的新方法和新希望。实时MRI示踪技术将有助于我们更好地研究胶质瘤细胞外间隙扩散的生物学基础，有助于恶性胶质瘤局部治疗的发展。

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