树鼩巴尔通体PCR方法的建立及初步应用

冯育芳, 邢 进, 付 瑞，巩 薇，贺争鸣，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

树鼩(tree shrew, Tupaia belangeri)，树鼩科树鼩属的动物，其许多分子和细胞结构近似于人类，且对多种人类重要病毒易感，可作为重要人类病毒的动物模型[1]；同时其在肿瘤学、内分泌学、神经生物学、生殖生物学、免疫学等方面的作用也得到科研人员的肯定，因此，树鼩作为一种新型的实验动物资源正越来越受到重视[2, 3]。而微生物背景规范化检测是树鼩实验动物化的必备条件之一[2, 3]。

巴尔通体(Bartonella)是巴尔通体病的病原体，已证实能感染多种温血动物( 犬、啮齿动物) 和冷血动物( 爬行类、两栖类) 脊椎动物[4-6]。而且有研究报道云南鼠群中存在巴尔通体感染[8]。巴尔通体还可以通过白蛉、跳蚤、蜱、虱及恙螨等昆虫媒介传播给人，可引起人类卡瑞恩病、战壕热、猫抓病、心内膜炎、菌血症等疾病，是一种广泛存在的人兽共患病原[5]。国内外部分动物已要求检测该菌。

1 材料和方法

1.1 菌株

伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae, 49227)，汉赛巴尔通体(B.henselae, 49882)和拉汉姆巴尔通体(B.grahamii, Birtles, 700132)购自ATCC，均为我国主要流行的巴尔通体菌株。用于特异性检测菌株分别为：肺链(31210)，肺链(36001)，乙链(32310)，小鼠放线(49577)，支败(19395)，支败(58401)，嗜肺(12555)，嗜肺(35149)，多杀(43137)，鼠棒(65013)，李斯特(54004)，支原体(MP)和支原体(15531)，均由本实验室保存鉴定。

1.2 引物设计

使用primer 5软件在巴尔通体保守序列区共设计3对引物，分别为引物对1、引物对2和引物对3，详细信息见表1；Oligo 6验证可用，并委托Takara公司合成。

1.3 样本采集及DNA提取

无菌采集树鼩EDTA抗凝血，吸取300 μL用于提取DNA；对照菌株纯培养后直接提取DNA，DNA提取使用Qiagen的Dneasy Blood & Tissue Kit (Cat. No.69504)，详细操作根据产品说明书。

1.4 PCR扩增体系

PCR反应体系为50 μL，包括：10×buffer 5 μL, dNTP 4 μL, DEPC水 29.75 μL，引物各2.5 μL，Hs Taq酶2.5 μL，DNA 5 μL。通过实验对PCR反应条件进行优化，PCR产物进行琼脂糖电泳检测，并送Takara公司进行序列测定。

1.5 特异性测定

将该理论扩增序列以及双向引物与GenBank上的序列进行blast比对，确定是否为特异性片段。另取本室保存的菌种(肺链(31210)，肺链(36001)，乙链(32310)，小鼠放线(49577)，支败(19395)，支败(58401)，嗜肺(12555)，嗜肺(35149)，多杀(43137)，鼠棒(65013)，李斯特(54004)，支原体(MP)和支原体(15531))按上述方法提取DNA，进行PCR扩增，检测不同细菌种间PCR扩增的特异性。

1.6 敏感性测定

对照菌株纯培养后，按上述方法直接提取DNA，将提取的DNA倍比稀释为20 μg/mL、2 μg/mL、2.0×10-1μg/mL、2.0×10-2μg/mL、2.0×10-3μg/mL、2.0×10-4μg/mL、2.0×10-5μg/mL、2.0×10-6μg/mL、2.0×10-7μg/mL、2.0×10-8μg/mL、2.0×10-9μg/mL、2.0×10-10μg/mL，用上述PCR方法进行测定，以确定其检测阈值。

2 结果

2.1 检测体系建立

为测试引物扩增效果及优化反应条件，将购自ATCC的巴尔通体(49227，49882和700132)作为阳性对照模板，通过实验对巴尔通体检测的引物进行筛选，结果见图1，引物对1特异性不好，出现了杂带；引物对3敏感性差，扩增结果与目的片段长短不符合；而引物对2条带清晰，无杂带，与目的片段长短相符，测序结果证实为巴尔通体序列，最后确定引物对2为本实验较为合适的检测引物。

后通过温度梯度实验对PCR反应条件进行优化，最后确定最适反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，重复35个循环；72℃ 7 min(图1)。

表1 引物名称、序列及扩增片段

图1 PCR扩增结果

图2 特异性试验

2.2 特异性测定

图2为特异性测定结果，1～13分别为肺链(31210)、肺链(36001)、乙链(32310)、小鼠放线(49577)、支败(19395)、支败(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多杀(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原体(MP)和支原体(15531)，P为阳性对照，汉赛巴尔通体(49882)，N为阴性对照。结果表明，只有阳性对照出现阳性条带，即该PCR方法的特异性较高。

2.3 敏感性测定

为测定该PCR方法的敏感性，选取汉赛巴尔通体(49882)培养液DNA提取物，使用无RNA酶水做11个稀释度，1～11为10倍系列稀释结果，从图3可见本实验方法最高可检测2.0×10-5μg/mL，灵敏度较好。

图3 敏感性试验

2.4 初步应用

从云南采集60份树鼩血样，提取DNA，并用优化后的PCR方法扩增特异性片段，以检测是否存在巴尔通体的感染。在这些样品中，共检出15个阳性标本(图4)；阳性样本送Takara公司进行测序，测序结果进行blast比对，显示这些样本均为巴尔通体阳性，充分验证了本检测方法的灵敏性和特异性。

图4 树鼩样本巴尔通体检测结果

3 讨论

树鼩作为近年来最有潜力的实验动物之一，正在进行系统的实验动物化工作[1-3]。云南是我国树鼩资源最丰富的地区，也是树鼩应用研究最发达的地区[2]。同时，云南也是我国最早进行巴尔通体系统研究的省份，为了解巴尔通体在云南省的流行情况，1999年10月云南省地方病防治所与美国疾病预防控制中心虫媒传染病部联合在云南省的鼠群中开展调查，证实巴尔通体在云南人群和动物中普遍存在和广泛流行[8-10]。为了解巴尔通体在云南树鼩种群中的分布情况，本研究首先建立了一个巴尔通体PCR检测方法，并进行了特异性和敏感性测试，结果证明该方法的可行性。

之前，大部分动物巴尔通体的调查研究使用的是培养方法[10]，该方法为细菌检测的经典方法，但操作繁琐，灵敏性低，时效性差；近来，随着分子生物学技术的普及，也有部分实验使用了PCR方法[11, 12]，但由于巴尔通体的高度流行及基因型别的多样性，有必要建立针对树鼩种群的PCR检测方法。

本实验首次在云南来源树鼩中检出巴尔通体，提示树鼩也存在巴尔通体的感染，而且相对其他动物，如姬鼠属(Apodemus) (62.2%, 28/45)，家鼠属(Rattus) (41.5%, 27/65), 绒鼠属 (Eothenomys) (18.8%, 3/16)[6], 树鼩巴尔通体属于中等程度流行(25%, 15/60)，应该引起实验动物科技界足够的重视。

参考文献：

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