低剂量紫杉醇对膀胱出口部分梗阻后膀胱形态变化的影响*

王 博， 姜晓晓， 彭云鹏， 庄 岩， 孙晓青， 朱海涛

(徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏 徐州 221002)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是老年男性常见慢性疾病，长期梗阻引起膀胱形态结构改变，即便后期减轻或解除梗阻，患者的生存质量仍难以提高[1]。目前认为此种改变与膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction，BOO)后膀胱纤维化进程密切相关。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是传统抗肿瘤药物，近期研究发现小剂量使用紫杉醇可能有抗纤维化作用，已有其应用于肠纤维化狭窄中的临床报道[2]。本文通过建立大鼠BOO模型，观察小剂量紫杉醇对膀胱出口部分梗阻后膀胱形态变化的影响。

材 料 和 方 法

1 动物

雌性Sprague-Dawley (SD) 大鼠30只，SPF级，6～8周龄，体重180～200 g，购自徐州医学院实验动物中心。于徐州医学院动物实验中心适应性饲养7 d。

2 主要试剂与仪器

紫杉醇注射液购自湖北威尔曼制药股份有限公司。Masson染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。石蜡切片机(Leica)和快速低温恒温器(Leica)由徐州医学院附属医院病理教研室提供。中性甲醛和苏木素、尼康显微镜照相系统(Nikon Eclipse 80i)由江苏省肿瘤生物治疗实验室提供。H-600透射电镜来自Hitachi，超薄切片机来自LKB-V2088，由徐州医学院神经生物实验室提供。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1动物分组和模型建立 雌性SD大鼠随机分为3组：空白对照组10只、BOO组10只和紫杉醇组10只。BOO组与紫杉醇组用2%戊巴比妥钠以30 mg/kg剂量腹腔麻醉后固定，消毒。将直径1 mm硬膜外导管插入尿道至膀胱，取下腹部正中切口，逐层分离显露近端尿道，以导管为支架，用3-0丝线结扎尿道，松紧度以能自由移动导管同时带动周围组织为标准，拔出导管，缝合下腹部切口。空白对照组只在相同部位做相同手术操作，但不结扎尿道。紫杉醇组在模型建立开始，给予紫杉醇溶于生理盐水(0.3 mg/kg)后腹腔注射[3]，每周2次。空白对照组与BOO组以等体积生理盐水同时间腹腔注射。同等条件饲养，自由饮食。4周后，称量体重，取膀胱，去除周围脂肪与结缔组织，用滤纸吸净水分,称重。

3.2HE染色 膀胱组织于10%中性甲醛中固定24～48h后，依次给予乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡，包埋制成蜡块，切片6μm，行HE染色，光镜下观察膀胱肌层的增生情况。

3.3Masson染色及评价 如上切片脱蜡水化，苏木素10 min，流水冲洗5 min，复合染液染色5 min，冲去染液，磷钼酸1 min，冲去后滴加亮绿染液染色10 s，水速洗，置于60 ℃温箱中烘干，封片。用Image-Pro Plus 6.0软件分析胶原纤维面积/(胶原纤维+逼尿肌的面积)比值。每张切片随机统计5个视野后取平均值，以此比值来反应纤维化的程度。

3.4超微结构观察 膀胱离体后立即取体部组织，切成1mm×1mm×1mm大小，2.5%戊二醛中4 ℃固定2h，0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3遍，1%锇酸溶液固定2h，双蒸水洗3遍，依次放入梯度乙醇、90%-无水丙酮脱水，树脂：丙酮(1∶2)室温下浸泡2h，树脂：丙酮(2∶1)室温下浸泡2h，纯树脂室温下浸透2h，环氧树脂(Epon812)包埋聚合后修整包埋块，超薄切片机制作超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双染色，H-600型透射电镜下观察、照相。镜下主要观察逼尿肌细胞、成纤维细胞细胞器及细胞间连接的改变。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比较使用S-N-K法,方差不齐时采用Dennett’s方法作多重比较。应用SPSS 13.0统计软件处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠终末体重、膀胱重量及大体形态的观察

各组大鼠体重无明显差异[(217.00±10.46) g, (210.43±20.91) g, (212.63±11.89) g，P>0.05], 而在膀胱重量方面，BOO组[(0.376±0.052)g]明显高于空白对照组[(0.112±0.014)g，P<0.05]，紫杉醇组[(0.215±0.025)g]低于BOO组(P<0.05)。BOO组膀胱重量与体重比值[(0.180±0.025)%]高于空白对照组[(0.052±0.006)%，P<0.05]，而紫杉醇组[(0.101±0.013)%]低于BOO组(P<0.05)。

标本大体观察：BOO组膀胱中多出现大量浑浊尿液，抽取尿液后多残留有泥沙样细小结石，膀胱内壁出现明显小梁突向腔内，厚度较空白对照组膀胱明显增加。紫杉醇组膀胱内尿液颜色较清，较少发现结石，膀胱内壁略光滑，整体膀胱厚度较BOO组减小。

2 膀胱组织的HE染色观察

空白对照组逼尿肌肌束排列整齐，肌束间隙中被结缔组织所充满，胞浆均匀、胞核清晰。BOO组逼尿肌肌束肥大，肌细胞数量增多排列紊乱，肌束间隙减小。相比BOO组，紫杉醇组中平滑肌增生较弱，数量略少，肌束间隙略大，见图1。

Figure 1. Pathological changes of bladder tissues with HE staining (×400).

3 膀胱组织的Masson染色观察

胶原纤维为蓝染，主要位于黏膜下层与肌束之间，肌组织成红色。与空白对照组相比，BOO组表现为逼尿肌增生及胶原纤维数量均增加。紫杉醇组中逼尿肌细胞略增生，但胶原纤维与BOO组比显著减少，见图2。

Figure 2. Pathological changes of bladder tissues with Masson staining (×400).

各组平均胶原纤维所占面积比值分别为38.94%±3.67%、29.66%±2.69%和19.94%±1.90%。与空白对照组相比，BOO组胶原纤维面积比值显著下降(P<0.05);与BOO组相比，紫杉醇组胶原纤维面积比值显著下降(P<0.05)，见图3。

4 超微结构的改变

电镜下可见空白对照组肌细胞间间隙狭窄，间隙两侧可见有高电子密度物质堆积，即肌细胞通过典型的中间连接与邻近的细胞相连。质膜下，小泡与密斑较多。胞质内见少量线粒体，线粒体完整，形态与比例正常。胞核为椭圆形，染色质分布均匀。

BOO组中可见平滑肌外形较为肥大并且扭曲变形，肌间隙增宽，中有大量的胶原纤维蛋白，并且发现有部分类似胞浆细胞器损伤碎片脱落于间隙。细胞之间中间连接明显减少，出现大量突起交错，形成丰富的突触连接与桥粒连接。肌质膜下小泡与密斑缺乏。胞浆肌丝增多，颜色较深并且走形紊乱。胞质内线粒体丰富，出现水肿，内脊减少。粗面内质网增多，功能旺盛，胞质内同时出现空泡样变及脱颗粒现象。胞核大，分裂多见，染色质边集，部分出现核周水肿。间质中成纤维细胞中线粒体数量增加，内质网增多扩张，核皱褶增多，功能旺盛。

Figure 3. The percentage of the collagen area [collagen/(collagen+muscle)] in the rats with different treatments. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs BOO group.

紫杉醇组中平滑肌外形略肥大，相比空白对照组肌间隙增宽，细胞之间中间连接略减少，出现略多量突触连接与桥粒连接。胞质内线粒体略扩张，粗面内质网略增多。核膜增厚，染色质略紊乱，见图4、5。

Figure 4. Electron micrographs of fibroblasts and collagen fibers between detrusor smooth muscle cells. The examples of collagen deposition were highlighted with the arrows (→). Slight collagen fibers were observed in sham group, a great quantity of collagen fibers existed in the interstitium in BOO group, and the intercellular space contained less collagen fibers in low-dose paclitaxel group than that in BOO group. Scale bar=500 nm.

Figure 5. Electron micrographs of intercellular junction between detrusor smooth muscle cells. Scale bar=500 nm.

讨 论

BPH是一种慢性的、复杂的疾病, 虽然BPH是良性增生,但它会导致持续的尿路梗阻和下尿路刺激症状[4]，往往消极影响健康和生活质量。目前多针对病因行药物或手术治疗[5]，但在梗阻的后期即使消除梗阻仍然会有部分患者难以恢复正常的膀胱功能。以上这些症状的表现与膀胱形态结构的变化是密切相关的。Metcalfe等[6]的报道指出，BOO后膀胱的形态变化经历炎症渗出、逼尿肌增生和终末膀胱纤维化的过程，与此同时膀胱功能的变化也由代偿转向失功能的失代偿状态。

本实验中梗阻后膀胱重量显著增加，光镜下可见明显增生的肌细胞，黏膜下与肌束间胶原纤维增多，这些变化与Kitajima等[7]观察是相符的。BOO组纤维面积/(胶原纤维+肌肉面积)的值相比空白对照组的值要低，提示此时期肌细胞增生比胶原纤维迅速[8]。

对超微结构形态观察发现，BOO后肌细胞间中间连接明显减少，出现丰富的突触与桥粒连接。周逢海等[9]报道细胞连接方式从协同的机械偶联转变成局限传播的电偶联，此可能是引发膀胱不稳定收缩(DI)的重要原因。同时肌间隙出现大量胶原纤维，杨进益等[10]认为其富有的伸展特性使得膀胱的顺应性提高，韧性增加，考虑此是BPH患者出现慢性尿潴留的基础，而后期胶原纤维过量增多则引起膀胱顺应性下降[11]，最终引起膀胱纤维化。由此可见胶原纤维过度沉积是引发膀胱功能损害的主要因素[12]。因此早期控制胶原沉积、抑制纤维化进程是保护BOO后膀胱功能的重要前提。

紫杉醇是来源于太平洋紫杉树的树皮提取物，是一种通过稳定微管形态调节细胞代谢活动的抗肿瘤药物。近期研究发现小剂量紫杉醇可能在多种非癌疾病方面有治疗作用,如皮肤紊乱性疾病、肾肝纤维化、抑制炎症、保护缺血损伤和预防冠状动脉再狭窄等[13-14]。在胶原沉积引发疾病研究中，低剂量紫杉醇多有抑制纤维化进程的作用。

瘢痕形成中[15]，局部涂抹紫杉醇能降低大鼠损伤气道组织中成纤维细胞及炎症细胞数量，抑制瘢痕形成。在大鼠肺纤维化模型中发现[16]，注射低剂量紫杉醇(0.6 mg/kg)能降低肺湿重与体重比例，减轻肺纤维化程度，相应细胞水平研究中Sandbo等[17]发现，紫杉醇抑制肺纤维化可能通过调控转化生长因子β1介导的肌成纤维细胞分化实现。在大鼠单侧输尿管梗阻研究中[3]，腹腔注射低剂量紫杉醇(0.3 mg/kg，每周2次)能够降低胶原和纤联蛋白的表达，降低肾小管间质性纤维化程度。类似的情况还在大鼠肝纤维化、全身系统性硬化等不同领域不同器官的纤维化中有相关的报道。由此可以推测紫杉醇很有可能是治疗由胶原沉积引发疾病的有用药物。虽然低剂量紫杉醇在多种器官中有报道，但在膀胱纤维化进程中还未见此方面的相关研究。

本实验中，与BOO组相比，紫杉醇干预后膀胱重量显著降低，光镜下可见肌细胞体积略小，平滑肌增生减弱，在黏膜下与肌束间胶原纤维减少，并且胶原纤维面积/(胶原纤维+肌肉面积)比值要低于BOO组，提示紫杉醇可能对BOO后胶原纤维沉积有改善作用。在超微结构方面，紫杉醇组肌间隙减小，细胞之间出现略多量突触连接与桥粒连接，仍以中间连接为多见，肌细胞间隙内胶原纤维量减少，提示紫杉醇有可能通过形态方面影响对膀胱功能起到一定程度的保护作用。

综上所述，BOO后膀胱出现逼尿肌增生、胶原纤维沉积、细胞连接方式改变等形态变化，使用低剂量紫杉醇后对BOO膀胱形态改变有一定程度的改善作用，这可能是通过调控细胞增生、抑制纤维合成等方式实现的。这将为我们研究BOO后膀胱损伤的发展并保护膀胱正常功能提供重要线索。另外，本实验只是从形态学上初步探索低剂量紫杉醇对BOO后膀胱变化的影响，其内在具体分子机制以及紫杉醇使用的剂量效应关系还需进一步研究获得。

[参 考 文 献]

[1] Kuo HC. Analysis of the pathophysiology of lower urinary tract symptoms in patients after prostatectomy[J]. Urol Int, 2002, 68(2):99-104.

[2]SakuraiY,YoshidaI,TonomuraS,etal.Weeklyadministrationofpaclitaxelattenuatedrectalstenosiscausedbymultipleperitonealrecurrence8yearsaftertheresectionofgastriccarcinoma[J].GastricCancer, 2003, 6(4):243-249.

[3] Zhang D, Sun L. Low-dose paclitaxel ameliorates renal fibrosis in rat UUO model by inhibition of TGF-β/Smad activity[J]. Lab Invest, 2010, 90(3): 436-447.

[4]SarmaAV,WeiJT.Benignprostatichyperplasiaandlowerurinarytractsymptoms[J].NEnglJMed, 2012, 367(3):248-257.

[5] Roehrborn C. Benign prostatic hyperplasia and lower urinary tract symptom guidelines[J]. Can Urol Assoc J, 2012, 6(5 Suppl 2):S130-S132.

[6]MetcalfePD,WangJ,JiaoH,etal.Bladderoutletobstruction:progressionfrominflammationtofibrosis[J].BJUInt, 2010, 106(11):1686-1694.

[7] Kitajima K, Aoba T, Pringle KC, et al. Bladder development following bladder outlet obstruction in fetal lambs: optimal timing of fetal therapy[J]. J Pediatr Surg, 2010, 45(12):2423-2430.

[8]KuJH,KimY,MoonKC,etal. In vivohepatocytegrowthfactorgenetransfertobladdersmoothmuscleafterbladderoutletobstructionintherat:amorphometricanalysis[J].JUrol, 2006, 176(3):1230-1235.

[9] 周逢海，宋 波，金锡御，等. 逼尿肌不稳定缝隙连接介导细胞间通讯的研究[J].中华泌尿外科杂志, 2004, 25(4):260-262.

[10] 杨进益，叶 林，侯 旭，等. 前列腺增生症患者膀胱逼尿肌超微结构的研究[J]. 临床泌尿外科杂志, 2004, 19(1):34-35.

[11] Kim KM, Kang J, Jung JY. Morphometric analysis of the collagen changes induced by subcutaneous injection of interferon-gamma after bladder outlet obstruction in the rat[J]. Neurourol Urodyn, 2003, 22(1):70-76.

[12]deAlmeidaPradoPS,SoaresMF,LimaFO,etal.Amitriptylineaggravatesthefibrosisprocessinaratmodelofinfravesicalobstruction[J].IntJExpPathol, 2012, 93(3):218-224.

[13] Sun L, Zhang D, Liu F, et al. Low-dose paclitaxel ameliorates fibrosis in the remnant kidney model by down-regulating miR-192[J]. J Pathol, 2011, 225(3): 364-377.

[14]MilewskiK,AfariME,TellezA,etal.Evaluationofefficacyanddoseresponseofdifferentpaclitaxel-coatedballoonformulationsinanovelswinemodelofiliofemoralin-stentrestenosis[J].JACCCardiovascInterv, 2012, 5(10):1081-1088.

[15] 王利换，张 杰，陈 楠，等. 局部应用紫杉醇抑制兔气管损伤后瘢痕组织形成的初步研究[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2013, 36(3):202-206.

[16]WangC,SongX,LiY,etal.Low-dosepaclitaxelamelioratespulmonaryfibrosisbysuppressingTGF-β1/Smad3pathwayviamiR-140upregulation[J].PLoSOne, 2013, 8(8):e70725.

[17] Sandbo N, Ngam C, Torr E, et al. Control of myofibroblast differentiation by microtubule dynamics through a regulated localization of mDia2[J]. J Biol Chem, 2013, 288(22):15466-15473.