五步蛇毒PCA改善脓毒症大鼠的血管低反应性*

包鹏举， 孙 瑶， 王海华， 张根葆， 胡钱国， 蒋佳珅

(皖南医学院 1生理学教研室， 2病理生理学教研室， 3蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002； 4黄山市昌仁医院，安徽 黄山 245200)

脓毒症是由细菌和/或细菌产物感染和损伤引起的一种严重的临床综合征[1]，病程中常引起高热、寒战、呼吸急促和意识改变等一系列临床症状，若不及时治疗可进一步恶化引起休克、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascularcoagulation，DIC)，进而诱发多系统功能衰竭综合症(multiplesystemandorganfailure，MSOF)，致死率高，危害性大，严重影响人们的健康[2]。临床上现在除使用抗菌素及糖皮质激素作为常规治疗外，至今针对脓毒症的各种治疗手段尚未取得良好疗效[2-3]，因此深入认识脓毒症的发病机制，并积极寻求相应的干预策略已成为研究的重要课题。皖南地区五步蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒蛋白C激活物(proteinCactivator，PCA)是从五步蛇毒粗毒中提纯的一种组分[4-6]，具有防血栓、抑制血小板聚集、改善微循环等作用[7-8]。目前其对脓毒症大鼠血管张力的作用尚不清楚，机制亦不明了。为此，本实验通过复制实验性脓毒症大鼠模型，采用离体胸主动脉环灌流法，初步探讨五步蛇毒PCA对脓毒症大鼠血管张力的影响及作用机制，为临床治疗脓毒症提供新的理论依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和仪器

五步蛇毒PCA冻干粉由皖南医学院蛇毒研究所提供；大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)、硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)、去氧肾上腺素(phenylephrine，Phe)、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)和甲烯蓝(methylene blue，MB)均为Sigma产品；Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L)：NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O 1.2、NaHCO325、CaCl22.25和glucose 5.5，均为国产分析纯。离体血管环灌流装置和Medlab-U/8c生物信号采集分析系统购自南京美易科技有限公司。

2 动物和分组

清洁级SD雄性大鼠36只，体重(220±30) g，由皖南医学院实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(苏)2009-0001，实验前于清洁级环境适应性喂养3 d。

大鼠随机分成假手术组(sham组)、模型组(LPS组)、PCA干预组(LPS +PCA组，分0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.6 mg/kg剂量组)、阳性对照组使用多粘菌素B(polymyxin B,PMX-B) 0.2 mg/kg，(LPS+PMX-B组)。脓毒症模型复制成功后，LPS+PCA组、LPS+PMX-B组分别从尾静脉注入不同剂量同容量的PCA、PMX-B；LPS组则在复制脓毒症模型后从尾静脉注入同容量的生理盐水；sham组不复制脓毒症模型，仅从尾静脉注入同容量的生理盐水。

3 方法

3.1实验性脓毒症大鼠模型复制 SD雄性大鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg，4 h)建立实验性脓毒症大鼠模型[8-9]。LPS处理2 h后，动物即表现出盘索成团、萎靡不振、腹泻、活动度低下并伴有发绀、震颤等症状；LPS处理4 h后，血压明显下降，但大鼠没有死亡，说明脓毒症的实验动物模型复制成功(不符合上述条件的大鼠不纳入实验组内，各实验组大鼠不足预订数额则通过随机抽样原则补齐)。

3.2大鼠血压和心脏血流动力学指标测定 20%乌拉坦生理盐水溶液(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，行右颈总动脉插管。经Medlab-U/8c生物信号处理系统描记颈总动脉平均动脉血压(mean arterial blood pressure，MABP)；导管继续插入，至左心室，测定血流动力学相关指标：心率(heart rate，HR)、左室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)、心室内压最大上升/下降速率(maximal rise/fall velocity of ventricular pressure，±dp/dtmax)。监测各指标时先稳定30 min后，再记录20 min。

3.3离体主动脉环的制备与稳定[10]大鼠颈椎脱臼致死，迅速开胸，游离主动脉胸腹段，置于4 ℃氧饱和的K-H液平皿中，清除血污，仔细剔除周围结缔组织，剪成约3～4mm长的动脉环。避免过度牵拉，以防损伤血管。去除血管内皮时，用棉签磨擦血管环内表面以去除内皮细胞。主动脉环套入上下平行的两根不锈钢微型挂钩，水平悬挂于盛有10mLK-H液浴槽内，下方固定，上方以一细钢丝连于张力换能器，经Medlab-U/8c生物信号处理系统记录血管张力。主动脉环先以0g张力起步，平衡30min，逐步调节至最适初始张力1.5g并平衡1h。期间每15min换液1次，浴槽内持续通以 95%O2+5%CO2混和气体，并保持37 ℃恒温水浴。待稳定后，用60mmol/LKCl刺激收缩达峰值，然后用K-H液洗脱至基线，重复3次，以激发主动脉环最佳活性。待主动脉环重新稳定后浴槽内加入Phe(1×10-6mol/L)，收缩达峰值稳定后，给予1×10-5mol/LACh，检验血管内皮完整性。若加ACh后可使Phe预收缩的血管舒张达60%～90%则可认为内皮完整；反之，则认为内皮被破坏[11]。

3.4主动脉环收缩与舒张功能的测定 分别观察：(1) 间隔5 min累积给予浓度为1×10-8～1×10-5mol/L Phe诱导主动脉环的收缩反应；(2) 间隔5 min累积给予Phe达1×10-8～1×10-5mol/L诱导去内皮主动脉环的收缩反应；(3) 用Phe(1×10-6mol/L)收缩主动脉环，待收缩稳定后间隔5 min累积加入浓度为1×10-8～1×10-4mol/L ACh诱导主动脉环内皮依赖性舒张反应；(4) 用Phe(1×10-6mol/L)收缩主动脉环，待稳定后观察间隔5 min累积加入浓度为1×10-9～1×10-6mol/L SNP诱导的主动脉环非内皮依赖性舒张反应；(5) 分别用1×10-4mol/L特异性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制剂 L-NAME及1×10-5mol/L鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)抑制剂MB预处理20 min后，观察间隔5 min累积加入浓度为1×10-8～1×10-5mol/L Phe诱导的主动脉环收缩反应。以上每一轮实验完成后用K-H液反复冲洗3～5次，直至主动脉环张力恢复到实验前的基础水平才开始下一轮实验[10]。记录主动脉环收缩幅度，并计算血管收缩率(vascular contraction rate，VCR)。VCR(%)=(累加Phe后的主动脉环收缩张力-最适初始张力)/空白组最大收缩张力平均值×100%。血管舒张率(%) = (加Phe后的主动脉环收缩张力-累加ACh 后的血管张力)/(加Phe后的血管最大收缩张力-基础血管张力)×100%[10]。

4 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组均数比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MABP和血流动力学的变化

LPS组大鼠MABP与sham组比明显下降(P<0.01)；PCA干预后大鼠MABP则显著升高(P<0.05)。同sham组比较，LPS组大鼠HR、LVDP、±dp/dtmax均明显下降(P<0.01)。LPS+PCA组左心室血流动力学各指标均有明显升高(P<0.05)，心肌收缩力显著改善；但与sham组比较, 仍有明显差异(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠MABP和血流动力学指标的改变

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

2 PCA对Phe引起主动脉环收缩反应的影响

LPS组主动脉环对Phe刺激的收缩反应量效曲线比sham组明显下降(P<0.01)；PCA干预组(尤其是0.6 mg/kg剂量组)的主动脉环对Phe刺激的收缩量效曲线显著高于LPS组(P<0.01)，见图1。

Figure 1. Effects of phenylephrine (1×10-8～1×10-5 mol/L) on the tension of the rat aorta rings. Mean±SD. n=6. *P<0.05, ** P<0.01 vs sham group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS group.

3 PCA对Phe引起去内皮主动脉环收缩反应的影响

同sham组比较，LPS组去内皮主动脉环对Phe刺激的收缩反应量效曲线显著降低(P<0.01)；而LPS+PCA组去内皮主动脉环对Phe的收缩反应与LPS组相比则无显著差异(P>0.05)，见图2。

4 PCA对ACh引起主动脉环舒张反应的影响

LPS组主动脉环对ACh引起的内皮依赖性舒张反应较sham组明显降低(P<0.01)，PCA干预组(尤其是0.6 mg/kg剂量组)对1×10-4mol/L ACh诱导的舒张反应较LPS组显著增加(P<0.01)，见表2。

Figure 2. Effects of phenylephrine (1×10-8～1×10-5 mol/L) on the tension of the rat aorta rings with endothelium denudation. Mean±SD. n=6. *P<0.05, ** P<0.01 vs sham group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS group.

表2 各组大鼠主动脉环对ACh诱导的舒张反应

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

5 PCA对SNP引起主动脉环舒张反应的影响

用1×10-6mol/L Phe收缩主动脉环，待稳定后观察间隔5 min累积加入浓度为1×10-9～1×10-6mol/L SNP诱导主动脉环非内皮依赖性舒张反应。各组主动脉环对SNP诱导的舒张反应无明显差异(P>0.05)，见表3。

表3 各组大鼠主动脉环对SNP诱导的舒张反应

6 不同抑制剂预处理后主动脉环对Phe刺激的收缩反应

经L-NAME(1×10-4mol/L)和MB(1×10-5mol/L)预处理20 min后，各组主动脉环对Phe诱导的收缩幅度均有所升高。但L-NAME或MB预处理前后相比较，PCA干预组(0.6 mg/kg)对1×10-5mol/L Phe诱导的收缩幅度的差值同sham组相比无显著差异(P>0.05)，却明显低于LPS组(P<0.05)，见表4、5。

表4 主动脉环经L-NAME预处理后对Phe刺激的收缩反应

△△P<0.01vssham;□□P<0.01vsLPS;○P<0.05,○○P<0.01vsLPS+0.1 mg/kg PCA;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsLPS+0.3 mg/kg PCA;■P<0.05,■■P<0.01vsLPS+0.6 mg/kg PCA;●●P<0.01vsLPS+PMX-B;*P<0.05,**P<0.01vssham+L-NAME;#P<0.05vsLPS+L-NAME.

表5 主动脉环经MB预处理后对Phe刺激的收缩反应

△△P<0.01vssham;□□P<0.01vsLPS;○P<0.05,○○P<0.01vsLPS+0.1 mg/kg PCA;▲▲P<0.01vsLPS+0.3 mg/kg PCA;■■P<0.01vsLPS+0.6 mg/kg PCA;●●P<0.01vsLPS+PMX-B;*P<0.05,**P<0.01vssham+MB;#P<0.05,##P<0.01vsLPS+MB.

讨 论

脓毒症病情凶险，病死率高，临床治疗困难，已成为现代危重病医学面临的突出难题[12]。尽管现代医学对疾病的研究方法有了很大进步，但在对脓毒症的临床治疗上，仅是包括使用抗生素、清除感染等常规支持疗法[1]，并未取得突破性的进展。

目前对脓毒症发病机制的研究归益于多种动物实验模型的建立，主要有直接注射外源毒素(LPS、zymogen等)、盲肠结扎穿孔法(ceacal ligation and puncture，CLP)、腹腔包埋污秽物等[9]，而众方法中又以注射LPS最为常用，可以在短时间内使模型动物达到脓毒症晚期，且方法简单方便有效[13]。本实验通过腹腔注射LPS建立实验性脓毒症大鼠模型。实验证实，LPS处理4 h后，大鼠的MABP、HR、LVDP、±dp/dtmax等心功能指标较sham组均明显降低，这与临床脓毒症的发展特征十分吻合[14]。

脓毒症发生时的主要特征表现为全身血压不可逆性降低，而血管张力的调节无疑是参与血压调节的众多因素中主要因素之一。故本实验采用离体血管灌流法，初步探讨五步蛇毒PCA对脓毒症大鼠血管张力的影响及其可能机制。

既往研究[5-8]证实本实验室前期从五步蛇毒粗毒中已提纯出蛋白C 激活剂组分，具有抗血栓、改善微循环等效应，但目前其对血管作用机制研究尚未见相关报道。本研究中离体主动脉环灌流实验结果显示，LPS+PCA组主动脉环对Phe刺激的收缩反应量效曲线比LPS组明显升高，而在去除主动脉环内皮后则与LPS组无显著差别。通常情况下由血管内皮细胞上的M受体介导的血管舒张作用总是强于血管平滑肌细胞M受体介导的血管收缩作用，因此只要内皮存在时ACh总是引起血管舒张，血管内皮损伤时ACh的舒张作用就会减弱[15]。本实验发现，LPS组主动脉环对ACh内皮依赖性舒张反应明显降低，而经PCA干预(特别是0.6 mg/kg剂量组)主动脉环对ACh舒张反应较LPS组显著增加；另外，实验还观察到各组主动脉环对累积浓度的SNP非内皮依赖性舒张反应均无明显差异。由此可推测五步蛇毒PCA可通过保护血管内皮功能改善脓毒症大鼠血管低反应性。

为进一步阐明PCA改善脓毒症血管低反应性的作用机制，实验分别使用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME、GC抑制剂MB预处理主动脉环。一般认为，血管内皮细胞通过NOS催化L-精氨酸与氧结合后释放NO，NO激活细胞GC，活化的GC使三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)转变为环磷酸鸟苷(cyclie guanosine monophosphate，cGMP)，使细胞内cGMP水平升高，继而激活cGMP依赖性的蛋白激酶PKG，使细胞内Ca2+浓度降低，促使肌球蛋白轻链脱磷酸化，平滑肌松弛，血管舒张[15-16]。LPS及其诱导产生的细胞因子刺激NOS过量表达，继而生成高浓度NO，在体内发挥负性肌力作用，尤其是可通过NO-GC-cGMP通路降低平滑肌细胞游离钙的水平，介导血管的低反应性[15]。实验结果发现，各组大鼠主动脉环经L-NAME、MB预处理后对Phe刺激的收缩反应均有不同程度升高，尤其是LPS组主动脉环收缩明显增强。但L-NAME预处理组与未处理组比较，0.6 mg/kg PCA干预组主动脉环对1×10-5mol/L Phe引起的收缩幅度的差值显著低于LPS组，提示PCA可明显降低由LPS诱导的NOS过量表达，继而也相应减少NO过量生成。再者，MB预处理前后比较，LPS组主动脉环收缩反应升高幅度的差值同样也明显高于sham组，PCA干预组则和sham组无显著差异，这也说明LPS组主动脉环通过NO-GC-cGMP途径对NO的敏感性较sham组高，而PCA可经NO-GC-cGMP通路降低对NO的敏感性，增强主动脉平滑肌的收缩反应，继而逆转脓毒症发生时由血管低反应性引起的低血压。

综上所述，本实验认为五步蛇毒PCA对脓毒症大鼠血管内皮功能有保护作用，通过抑制NO-GC-cGMP信号通路，防止iNOS过度活化及NO的过量生成，从而改善脓毒症大鼠血管的低反应性，至于其确切机制尚需进一步研究。

[参 考 文 献]

[1] 莫 冰，刘占国，常 平．细胞外组蛋白对脓毒症的影响[J]．中华危重病急救医学，2014，26(3):204-205．

[2] Shiramizo SC, Marra AR, Durão MS, et al. Decreasing mortality in severe sepsis and septic shock patients by implementing a sepsis bundle in a hospital setting[J]. PLoS One, 2011, 6(11):e26790．

[3]StevensJH,O’HanleyP,ShapiroJM,etal.Effectsofanti-C5aantibodiesontheadultspiratorydistresssyndromeinsepticprimates[J].JClinInvest, 1986, 77(6):1812-1816．

[4] 张根葆，张 毅，孔 岩，等．五步蛇毒蛋白C激活剂的纯化与活性分析[J]．蛇志， 2008，20(4):249-251．

[5] 孙 瑶，张根葆，吴 娟．影响五步蛇毒蛋白C激活剂酰胺酶活性的实验因素[J]．皖南医学院学报， 2010, 29(6):409-411．

[6] 孙 瑶，包鹏举，张根葆．毛细管区带电泳分析五步蛇毒蛋白C激活剂和蛋白C的相互作用[J]．色谱， 2013, 33(1):59-63．

[7] 张根葆，陈冬云，周志泳，等．蝮蛇毒蛋白C激活物的纯化与抗血小板活性[J]．皖南医学院学报，2005, 24(1):8-10．

[8] 王海华，许 敏，张 翠，等．蝮蛇毒蛋白C激活物对败血症大鼠心脏血流动力学的作用研究[J]．皖南医学院学报， 2007, 26(4):247-249．

[9] 汤耀卿，李 磊．脓毒症动物模型制作方略及应用[J]．中华实验外科志， 2011, 23(12):1433-1434．

[10] 王海华，闵志雪，戚仁斌，等．iNOS-GC-cGMP信号活化参与了内毒素血症大鼠血管低反应性的发生机制[J]．中国病理生理杂志， 2012, 27(6):1076-1081．

[11] 包鹏举，戚仁斌，王海华，等．银杏达莫注射液对高钾血症大鼠离体血管张力的影响[J]．中国病理生理杂志，2011, 22(1):52-55．

[12] 杨 睿，王东强，李志军．盲肠结扎穿刺大鼠脓毒症模型改良[J]．中外医疗, 2014, 33(5):37-39．

[13]BarbeiroHV,BarbeiroDF,DebbasV,etal.Purinenucleotidesreducesuperoxideproductionbynitricoxidesynthaseinamurinesepsismodel[J].BrazJMedBiolRes, 2009, 42(11):1050-1057．

[14] Sessler CN, Perry JC, Varney KL. Management of severe sepsis and septic shock[J]. Curr Opni Crit Caer, 2004, 10(5):354-363．

[15] 韩启德，文允镒．血管生物学[M]．第1版．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997:74-79．

[16] Tanaka Y, Koike K, Toro L. MaxiK channel roles in blood vessel relaxations induced by endothelium-derived relaxing factors and their molecular mechanisms[J]. J Smooth Muscle Res, 2004, 40(45):125-153．