柱花草胶孢炭疽菌致病力鉴定和致病类型分析

易克贤　郑金龙　贺春萍　习金根　高建明　张世清　陈河龙　刘巧莲

摘 要 用2套鉴别寄主分别对47份A型菌和57份B型菌的致病力进行鉴定，研究表明，不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同。应用最大似然法（EML法）对鉴别寄主的致病力鉴定结果进行聚类分析，A型菌可划分成3大小种类型，且其聚类非常紧凑，表现出一定的寄生专化性；而B型菌可划分成2大小种类型，但其在型内分化较为复杂，说明B型菌将来有可能分化出更多的小种类型。从地区而言，无论A型菌还是B型菌均表现为海南菌株的致病力最强，其中尤以昌江和东方的菌株致病力最强。因而对病原变异和进化动态的监测十分必要。

关键词 柱花草 ；炭疽病 ；致病力 ；鉴定 ；分析

分类号 S435.4

柱花草（Stylosanthes spp.）又名笔花豆，天然分布在中南美洲、热带北美洲、非洲及东南亚[1]。柱花草是热带、亚热带地区的优质牧草，具有很大的发展潜力[2]。作为放牧和刈割兼用型牧草，中国于1961年首次将疏毛柱花草（Stylosanthes gracilis Kunth.）作为幼龄橡胶园等种植园的绿肥覆盖材料成功引入，起初表现良好，后因易感炭疽病而频临毁灭[3-9]。柱花草炭疽病（Stylo anthracnose）是目前严重影响柱花草生产和推广的主要病害，该病可造成牧草叶片变黄、坏死脱落，茎和叶柄枯萎，花序败落不结籽，严重时使幼苗和整个成株死亡，牧草产量和种子产量锐减甚至绝收。中国自推广种植柱花草以来，由于受到柱花草炭疽病的危害，其产量受到严重影响[10]。柱花草炭疽病病原菌存在高度的生物多样性和遗传变异性[11]，同一品种的柱花草在不同地点的感染程度有异；而且一个抗病的柱花草品种使用3～5 a后就会变成感病品种，即品种抗病寿命一般只有5 a左右[12]。柱花草炭疽病病原菌的地理分布与柱花草宿主的自然分布相关。据笔者1997年对中国广东、广西、海南3省的14个主要柱花草生产市县进行调查，发现中国柱花草同时存在A、B 2种专化型[2]。由于中国目前推广种植的柱花草主要是圭亚那种，因此危害中国柱花草的主要是B型胶孢炭疽菌，但其小种尚不清楚。因此，本研究对柱花草炭疽菌进行致病力鉴定和致病类型分析，为有效控制该病流行打下基础，也为筛选高抗炭疽病的育种材料和基因资源提供条件。

1 材料与方法

1.1 材料

鉴定的病原菌材料共104份，其中A型菌47份、B型菌57份，A型菌用柱花草品种Seca（40292），36260，Q10042，93116，2323，2534，2539，Fitzroy，Endeavour（为交叉鉴别寄主）作鉴别寄主； B型菌用Endeavour，Schofield，Cook，Graham，Oxley，Fitzroy（为交叉鉴别寄主）作鉴别寄主。

供鉴定的A型菌株：CH306，CH100，CH224，CH247，CH237，CH275，CH243，CH076，CH349，CH311 CH286，CH242，CH269，CH231，CH235，CH292，CH295，CH058 CH293 CH321 CH087，CH378，CH288，CH505，CH345，CH506，CH512，CH377，CH504，CH509，CH508，CH110，CH036，CH343，CH502，CH511，CH501，CH380，CH379，CH513，CH163，CH376，CH089，CH026，CH691，CH693，CH037；

供鉴定的B型菌株：CH055，CH052，CH011，CH025，CH066，CH016，CH115，CH005，CH018，CH004，CH251，CH100，CH002，CH013，CH008，CH003，CH111，CH010，CH020，CH024，CH026，CH238，CH021，CH118，CH014，CH290，CH253，CH362，CH023，CH678，CH690，CH698，CH674，CH683，CH687，CH697，CH684，CH679，CH451，CH696，CH700，CH669，CH691，CH702，CH484，CH672，CH699，CH670，CH542，CH675，CH526，CH694，CH452，CH450，CH671，CH695，CH677。

1.2 方法

试验工作流程：鉴别寄主种子和苗床土壤基质准备→播种→苗期管理→病原菌繁殖→接种→病情严重度评定→数据分析

1.2.1 准备寄主种子和苗床土壤基质

挑选足够的专门繁殖的寄主种子，用细砂布轻轻擦破种皮，以利种子萌发。

将消毒好的砂土均匀装入育苗盘或杯至一半高度，然后再用消毒好的混合土（表土∶砂=2∶1）装满剩余的一半。

1.2.2 播种

2005年3月播种，随机区组设计，重复3次。首先插入标签，然后按标签正确播种，每杯播种2～3粒。

1.2.3 苗期管理

播后初次浇水施用多菌灵或苯来特，以防幼苗枯萎病。每天检查苗床湿度情况并及时浇水，通常每天浇水1次，注意不要过量。每2周用NPK专用肥溶于水中浇1次。当苗长至10 cm时间苗1次，每杯留苗1株。

1.2.4 炭疽菌繁殖

在接种前2周，即播种后的第5周，用PDA培养基扩繁待试的炭疽菌。

1.2.5 接种

播种后第6周开始接种。用毛刷轻轻洗下培养基上的孢子，再用灭菌水配成孢子悬浮液，调节浓度为1.0×106个孢子/mL，立即用小喷雾器喷雾接种。接种后将育苗盘移入水盆中并用有机透明玻璃罩或塑料罩罩住，在饱和湿度下保湿生长48 h后，除去水盆和罩子，再按接种前苗期管理程序操作。

1.2.6 病情严重度评价

接种14 d后，根据 Horsfall-Barrat 的分类标准[13]，按0～9级分级法对幼苗发病情况进行评定，计算病情指数。病情指数计算公式：病情指数=100×∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）。病情指数分级标准如下：endprint

0级 无可见病斑；

1级 1～3%叶片或茎段有病斑；

2级 4～6%叶片或茎段有病斑；

3级 7～12%叶片或茎段有病斑；

4级 13～25%叶片或茎段有病斑；

5级 26～50%叶片或茎段有病斑；

6级 51～75%叶片或茎段有病斑；

7级 76～87%叶片或茎段有病斑；

8级 88～94%叶片或茎段有病斑；

9级 95～100%叶片或茎段有病斑。

2 结果与分析

不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同。应用最大似然法（EML法）对鉴别寄主的致病力鉴定结果进行聚类分析，A型菌在值-900处可划分成3大小种类型，而B型菌在值-600处可划分成2大小种类型（图1、2）。2002年，笔者曾对25个A型菌进行过毒力鉴定，并将有关数据发往澳大利亚热带植物病理学研究中心（CRCTPP）与其他国家的相关鉴定材料进行纵向综合分析，澳大利亚专家认为可能存在5个小种类型[14]。

从A型菌看，A型菌表现为一定的寄生专化性，主要侵染粗糙柱花草、有钩柱花草，特别是A-3类菌株没有发现侵染圭亚那种柱花草，仅侵染粗糙柱花草（表1、5）。从地区而言，海南3类菌株均有，而广东仅有A-2类菌株（表3）。从致病力来看，A-3类所有的菌株致病力都是测试菌株中最强的，且A-3、A-1类菌株均为海南所特有。海南菌株在3省区中致病力最强，尤其以儋州CH0288、CH0292、CH0275、CH0237、CH0247、CH0306、东方CH0087、昌江CH0037菌株致病力最强，广东的CH0505菌株在后期的侵染较强，广西菌株致病力最弱（图1、表7）。值得特别注意的是CH0306，该菌株能侵染较抗病的西布拉柱花草新种质2534，有可能在将来形成强大的威胁。

从B型菌看，2类菌株均在3省区有分布（表2）。B型菌主要侵染圭亚那种柱花草（表4、6）。2类菌株中以B-2类的致病力最强，B-1类较弱，其中供试菌株中致病力最强的前10个菌株CH700、CH698、CH687、CH678、CH100、CH683、CH026、CH362、CH066、CH118全部出现在B-2类中。从地区而言，来自海南的菌株致病力最强，其中尤其以昌江和东方的菌株致力最强（图2，表8）。

3 讨论与结论

了解病原菌群体内致病性的分化或变异情况，对制定防治对策和指导抗病育种具有重要意义。本研究结果表明：不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同；从致病力鉴定结果看，A型菌存在3大致病类型，B型菌存在3大致病类型；但从聚类图看，A型菌聚类非常紧凑，而B型菌在型内分化较为复杂，说明A型菌具有一定的寄生专化性，而B型菌将来有可能分化出更多的小种类型。因而对病原变异和进化的动态监测十分必要。

将本研究的病原毒性鉴定结果与分子标记分析结果进行对比分析，可发现绝大多数致病力最强的菌株均来自于海南，有A-3类、B-2类菌株。因此，在海南特别是在昌江、东方、儋州进行柱花草种子生产时，必须引起足够的重视，种子生产应尽可能避开上述地区，同时对出售的种子应进行严格的消毒和检疫。

关于病菌群体毒性与DNA多态性的相互关系研究有许多文献提及。一般认为一些寄生程度较低的植物病原真菌的DNA多态性和毒性多态性大都存在较好的相关性，对于具有高度专性的活体营养菌如锈菌、白粉菌等的研究结果则不尽一致。Chakraborty等认为，柱花草炭疽菌毒性与DNA多态性之间无明显的关系[11]。由此看来，不同真菌种类的毒性与DNA多态性之间存在甚为复杂的关系，因为致病力的强弱除与病原本身遗传有关外，还与寄主、环境有强烈的相互作用，并在一定程度上还受到人为因素的影响，因此弄清各自的特点，对于深入研究病原致病性的遗传和变异至关重要。

参考文献

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