水相合成CdSe量子点用于荧光标记的光谱研究

杨 琴(长沙航空职业技术学院，湖南 长沙 410124)

水相合成CdSe量子点用于荧光标记的光谱研究

杨 琴
(长沙航空职业技术学院，湖南 长沙 410124)

生物素-亲和素系统(BAS) 已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。采用水相合成的CdSe纳米粒子标记生物分子亲合素，用荧光分光光度法研究了亲合素与量子点的结合作用，结果表明标记了亲合素的量子点发光强度高于单一的CdSe量子点，光谱峰位置稍微有所红移。通过改变体系的pH值，亲合素的浓度及荧光显微成像等手段，发现光谱的变化确实是由量子点和亲合素的结合作用所引起的，证明CdSe可以很好的用于生物标记。

量子点；CdSe；亲合素；荧光光谱；生物标记

荧光量子点(Quantum Dots，简称QDs)是一种半导体纳米微晶体，是由Ⅱ-Ⅵ族及Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒，由于其具有优异的光学光谱特征和光化学稳定性。与传统的荧光探针相比，量子点激发光谱宽，且连续分布，而发射光谱呈对称分布，且宽度窄，颜色可调，并且光化学稳定性高，通过调节晶粒的尺寸和组分还能控制发射光谱的位置，它在生命科学、分析科学、材料科学、免疫医学、检验检疫科学等传统及新兴的领域中都得到了广泛的应用，并取得了一定的研究进展，尤其是在生命科学的各个领域中，它的作用更是日益突出[1]。目前，人们已成功制备出各种高发光性能的量子点[2, 3]，如可见光区的CdTe，CdSe，CdS等，以及近红外区的CdHgTe，PbS，PbSe等。常用的量子点合成方法有水相合成法和有机相合成法。有机相制备条件苛刻，成本较高，且不适用于生物体系。水相合成法的原料来源方便，实验条件温和，无需对量子点表面进行亲水转相处理，水相合成的量子点尺寸一般小于5 nm，其表面键合的配体含有羧基和氨基等官能团，可以采用静电吸附或共价偶联等方法直接与生物分子连接，具有非常好的水溶性[4]。

近年大量研究证实，生物素—亲合素系统(Biotin-Avidin System，简称BAS)几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，该系统具有反应迅速、专一、稳定等特点。可一端偶联大分子生物反应体系，一端连接标记或支持材料，并产生多级放大效应。将量子点标记到亲合素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)上，在后续实验中利用生物素和抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)之间的高度特异性结合力将量子点标记到目标分子上，可广泛用于免疫标记和示踪分析及定量检测等方面，在医学、免疫组织化学等领域都有广泛的应用。

目前，有周华健等[5]以3-巯基丙酸(MPA)为稳定剂制备了CdTe量子点并对其进行了表征。万异等[6]研究了水相溶液中巯基丙酸包覆的CdTe量子点与亲和素的结合作用, 但以L-半胱氨酸为稳定剂合成CdSe量子点用于标记亲合素方面还需进一步研究。本文研究以L-半胱氨酸为稳定剂，合成水溶性CdSe量子点，利用其良好的荧光特性，研究CdSe量子点与亲合素的结合作用。在选定的pH值条件下合成的CdSe量子点表面被L-半胱氨酸包覆带负电荷，能与带正电荷的生物分子通过静电相互作用而结合，见图1。同时本文还对不同pH值和不同浓度亲合素作用下的CdSe量子点进行比较并表征其相关特性，该方法简便、快速，为进一步用量子点标记生物素化蛋白、抗体或DNA奠定了基础。

图1 量子点和亲合素作用原理

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

L-半胱氨酸，上海陆安生物科技有限公司；无水亚硫酸钠(Na2SO3)，上海埃彼化学试剂有限公司；硒粉，天津市化学试剂研究所；二水醋酸镉(Cd(CH3COO)2·2H2O)，天津市化学试剂二厂；天津市科密欧化学试剂有限公司。亲和素(avidin)，上海纯优生物科技有限公司。将亲合素溶于pH 7.33的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并于0～4℃下保存。所有试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

用荧光分光光度计(日本日立，F-4500)测定荧光光谱，激发波长320 nm，光缝宽度5 nm；采用倒置荧光生物显微镜(美国ACCU-SCOPE，3032)表征量子点的颗粒大小及形态。

1.2 CdSe量子点的制备

实验所用尺度较为均一的CdSe纳米晶体的制备如文献[7]中已有详细报道，先制备Na2SeSO3，在10mL超纯水中加入0.5 mmol的Na2SO3，在磁力搅拌下缓慢加热至50℃左右，迅速加入1.5 mmol硒粉，继续加热至80℃约1小时，搅拌至硒粉充分溶解，得到的溶液为黄色透明的Na2SeSO3溶液。

制备CdSe量子点：将1.5 mmol的L-半胱氨酸(L-Cys)与50 mL去离子水配成溶液，超声分散均匀，再加入1 mmol的Cd(CH3COO)2·2H2O，用0.1 M NaOH调节混合液的pH值为8.0，通入均匀的氮气10 min后，将10 mL已合成的Na2SeSO3溶液快速加入到混合液中，再缓慢加热至30℃，搅拌回流，自然冷却到室温后停止通氮气，得到10 mM水溶性CdSe/Cys纳米微体系。

1.3 CdSe量子点标记亲合素

用PH=7.3的PBS缓冲溶液分别稀释亲和素和CdSe纳米粒子，然后向纳米粒子溶液中加入一定量的亲和素，室温下混合均匀。

2 结果与讨论

2.1 Avidin和CdSe量子点的光学性质

(a)Avidin在PBS缓冲液中的荧光发射光谱 (b)CdSe量子点在PBS缓冲液中的荧光发射光谱

图2为PBS缓冲液中亲和素的荧光光谱和CdSe量子点的荧光发射光谱，激发波长为320 nm，激发和发射狭缝均为5 nm。由图2可知，CdSe量子点在525 nm处有一强的荧光发射带。亲合素在338 nm处有一弱峰，由于两种物质的峰位置不同，在450-600 nm波长范围内，由亲和素分子自身发出的荧光不会对CdSe量子点的荧光测定产生影响，因此可以用CdSe量子点来修饰亲合素来进行生物表征。

2.2 CdSe-Avidin标记物性能的表征

图3 CdSe量子点和CdSe-Avidin标记物荧光发射光谱

图3为CdSe量子点和CdSe量子点结合亲合素后的荧光发射光谱，CdSe浓度为5mM。曲线a为量子点，b为CdSe-Avidin标记物。从图中可以看出，CdSe标记亲合素后荧光峰位稍有红移，峰强明显增强，而CdSe与CdSe-Avidin的发射谱的半峰宽基本不变。引起发射峰位变化的原因是CdSe量子点与亲和素通过静电相互作用结合，量子点间的距离缩短，粒径增大，粒子间偶极与偶极的相互作用增加，从而使其Stokes位移增大，CdSe-Avidin的发射谱相对于单一CdSe量子点的发射光谱发生了红移[8]。CdSe与CdSe-Avidin的发射谱的半峰宽基本不变，表明在标记过程中量子点之间没有发生团聚，分散较均匀。峰强增加表明亲合素对量子点有修饰作用，能减少量子点表面的缺陷，使荧光强度增大。

为了更进一步证实CdSe纳米粒子与亲和素分子之间发生了相互作用，考察了不同浓度亲和素与一定浓度的CdSe量子点发生作用后的荧光发射光谱，如图4所示，激发波长320 nm。由图可知，CdSe量子点分别加入不同浓度的亲和素溶液后，溶液的荧光强度会逐渐增加，当溶液加入亲和素为100 μg /mL时，荧光强度有最大值，这就表明亲和素对量子点表面缺陷有修饰作用。亲合素与量子点的结合除了静电引力作用之外，可能还有L-半胱氨酸上的-COOH与蛋白质的氨基酸残基在偶联剂作用下产生共价偶联作用[9]。这两种方式的结合均可以降低量子点的表面缺陷，增大量子点的荧光强度。当加入过量蛋白质后，剩余蛋白与结合蛋白之间或蛋白质之间产生交叉结合，可能使部分量子点产生聚集，使荧光强度反而略有降低。

图4 CdSe量子点溶液中分别加入亲和素a-e: 20,40,60,100,150μg /mL时溶液的荧光强度. pH：7.38, CdSe浓度：5 mM

图5 在不同pH条件下将亲合素加入量子点溶液后的荧光强度。a-e: 3.14，6.45，7.38，8.00，10.78. 亲合素浓度：40 μg /mL，CdSe浓度：5 mM.

为了进一步证实加入了亲和素后CdSe量子点溶液发射光谱的变化是CdSe量子点与亲和素分子通过静电相互作用的结果, 调整CdSe-Avidin量子点溶液的pH值，测得荧光光谱，如图5所示。亲和素的等电点为10.5[6]，溶液pH值小于等电点时，亲合素带正电荷，当pH值大于等电点时，亲合素带负电荷。当所用PBS缓冲液的pH值为10.78时，发现加入了亲和素的CdSe量子点溶液的发射峰位没有发生变化，还在525 nm处。这是由于，当溶液的pH为10.78时，亲和素显负电，与带相同电荷的CdSe量子点相互排斥，所以两者之间不会发生静电相互作用，即荧光发射峰位不会发生变化；而当溶液的pH为7.38和6.45时，发射峰位置稍有红移，这是因为在此pH条件下，亲和素显正电，因此能通过静电相互作用与带负电荷的CdSe量子点结合，使得量子点尺寸增大。这也进一步说明CdSe-Avidin量子点溶液发射光谱的变化确实是由CdSe量子点与亲和素之间的结合反应引起的。

由图5可知，在不同PH条件下，亲和素和量子点溶液的结合对量子点荧光强度有较大的影响。量子点本身是在弱碱性溶液中制备的，在酸性溶液中容易溶解，元素之间的结合力不强，而致使荧光强度发生明显减弱。在中性溶液和弱碱性溶液中量子点与亲和素作用后，量子点表面缺陷得到修饰，其荧光强度稍有增加。而在强碱性溶液，由于溶液中存在过量的OH-离子，亲和素对CdSe表面修饰作用不强，量子点颗粒缺陷增加，表面钝化，荧光强度有所降低。

为了更进一步考察CdSe纳米粒子与亲和素分子之间发生的作用及结合后粒子的形态，采用荧光倒置显微镜分别观察了单独的CdSe纳米粒子及用CdSe纳米粒子标记后的亲和素分子，所得到的荧光显微镜图像如图6所示，图6(a)为CdSe纳米微粒的倒置荧光显微镜图。从图中可以看出，纳米粒子呈类球形，尺寸分布较为均一，粒径小于10 nm。图6(b)为CdSe-Avidin标记物的倒置荧光显微镜图，其形状也近似呈球形，粒子直径尺寸相对CdSe纳米粒子明显增大，表明CdSe与亲合素的确发生了结合。显微镜结果和荧光光谱结果一致，亲和素结合量子点后，粒径增大。其中原理为稳定剂L-半胱氨酸通过巯基的硫原子与CdSe量子点微粒表面的富镉离子进行结合，半胱氨酸分子中的氧原子参与了量子点表面的金属离子配位作用，羧基在量子点中以羧酸盐的形式存在[10]。从而量子点表面被半胱氨酸包覆带负电荷，与带正电荷的亲合素通过静电作用相结合。

图6 CdSe量子点和CdSe-Avidin标记物的倒置荧光显微镜图

3 结论

实验表明，在水溶液中制备CdSe量子点，并于亲合素混合，可以成功的把CdSe量子点标记到生物素上，再利用生物素-亲和素系统，将制备的CdSe-Avidin标记物与生物素化的抗体、核酸、受体结合，就可把量子点标记到细胞、核酸、蛋白质上，进行示踪检测和功能研究，为量子点的应用提供一种通用的标记物。

[1] 范萍. 水溶性量子点荧光探针的制备及其在食品分析检测中的应用[D]. 湘潭：湘潭大学，2013.

[2] 沈冉. 强荧光量子点的合成、性质及其在生物标记方面的应用[D]. 合肥：中国科学技术大学, 2013.

[3] 刘剑波. 量子点的制备、成像及其在化学生物分析中的应用研究[D]. 长沙：湖南大学，2011.

[4] 李众，祝欣，董朝青，等. 荧光量子点的水相合成及其在化学和生物分析中的应用[J]，高等学校化学学报，2010，(10).

[5] 周华健, 曹立新, 高荣杰, 等. 水溶性CdTe量子点荧光探针的制备表征及应用[J]. 发光学报，2013, (7).

[6] 万异, 林章碧, 陈奇丹, 等. 水相合成CdTe量子点标记亲和素前后光谱变化的研究[J]. 分析仪器, 2004, (3).

[7] Wang Q., J.N.Chen & H.X.Zhang,et al. Synthesis of Water Soluble Quantum Dots for Monitoring Carrier-DNA Nanoparticles in Plant Cells[J].JNanosci.Nanotechnol., 2011, (3).

[8] 林章碧，陈奇丹，张皓,等. 水相合成CdTe量子点标记亲和素前后光谱变化的研究[J]. 分析仪器, 2004, (3).

[9] 杨冬芝，孙世安, 陈启凡，等. CdSe量子点与蛋白质的作用研究[J]. 激光生物学报，2007，(5).

[10] 王琼, 陈介南, 章怀云,等. 水溶性量子点制备条件的优化及表面修饰[J]. 材料导报，2009，(10).

[编校：张芙蓉]

Spectroscopic Studies of Fluorescent Labeling of CdSe Quantum Dots Synthesized in Aqueous Solution

YANG Qin

(ChangshaAeronauticalVocationalandTechnicalCollege,ChangshaHunan410124)

The biotin avidin system (BAS) which has become a new technology is now widely used in such new technology as trace amounts of antigen, antibody qualitative analysis, quantitative detection and location observation research. The biomolecules avidin was labeled by CdSe nanoparticles synthesized in aqueous solution, and the combination and quantum dots were studied by fluorescence spectrophotometries. The peak intensity of emission spectrum of CdSe quantum dots bound to avidin point was significantly higher than that of independent CdSe quantum dots, and the peak position is slightly red shifted. The fact that the change of spectra is due to the binding of CdSe and avidin is further confirmed through experiments by changing pH values and avidin concentration of test solution. The results show that CdSe quantum dots can be well applied as biological tag.

quantum dots; CdSe; avidin; fluorescence spectra; biological tag

2014-10-18

杨琴(1981- )，女，湖南张家界人，讲师，理学硕士，研究方向为分析化学。

O657

A

1671-9654(2014)04-058-05