抗双链DNA抗体检测策略研究

谭太昌,王婷,张航烽*,龙武彬(.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科,成都 6007；.泸州医学院,泸州 646000；. 四川省医学科学院·四川省人民医院风湿免疫科,成都 6007)

·论 著·

抗双链DNA抗体检测策略研究

谭太昌1,王婷2,张航烽1*,龙武彬3
(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科,成都 610072；2.泸州医学院,泸州 646000；3. 四川省医学科学院·四川省人民医院风湿免疫科,成都 610072)

目的 研究临床检测抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)的最佳检测方案。方法 将60例系统性红斑狼疮(SLE)血清,30例其他疾病对照组(ODC)血清和30例正常对照组(NC)血清样本同时进行线性免疫印迹法(LIA),绿蝇短膜虫间接免疫荧光实验(CLIFT),鲑鱼精子纯化抗原酶联免疫吸附实验(ELISA-Ⅰ)和胎牛胸腺纯化抗原酶联免疫吸附实验(ELISA-Ⅱ),检测血清标本中的anti-dsDNA。结果 LIA检测anti-dsDNA灵敏度为58.33%,CLIFT为56.67%,ELISA-Ⅰ51.67%, ELISA-Ⅱ73.33%； 特异性分别为： LIA 71.67%,CLIFT 100.00%, ELISA-Ⅰ 93.33%,ELISA-Ⅱ 86.67%。ELISA-Ⅰ与LIA、CLIFT比较,检测结果差异无统计学意义(P>0.05)；ELISA-Ⅱ与LIA、CLIFT、ELISA-Ⅰ比较,检测结果差异具有统计学意义(P<0.01)。ROC分析显示ELISA-Ⅰ、ELISA-Ⅱ 曲线下面积(AUC)分别为0.764和0.882(P<0.01);如采用ROC曲线的截断点(cut-off point), ELISA-Ⅰ的灵敏度和特异性为55.00%和91.67%,ELISA-Ⅱ为81.67%和83.33%；根据ROC曲线将特异性设置为95.00%时,ELISA-Ⅰ和ELISA-Ⅱ的灵敏度分别降低到48.33%和50.00%。结论 4种不同的anti-dsDNA检测试剂盒显示出不同的检测性能。CLIFT和ELISA均可用于anti-dsDNA的常规检测,由于ELISA具有良好的灵敏度,因此可作为anti-dsDNA的筛查实验；而CLIFT特异性最佳,可作为确证实验。无论临床实验室采取何种检测方法,针对anti-dsDNA的阳性检测结果,实验室工作人员应与临床医生始终保持足够的联系和沟通,并意识到临床实验室选择不同anti-dsDNA检测方法的灵敏度和特异性差异问题。

抗双链DNA抗体；系统性红斑狼疮；间接免疫荧光法；酶联免疫吸附实验；免疫印迹法

抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)是系统性红斑狼疮(SLE)的血清学标志物,而且是临床上最常进行的一项实验检测指标[1]。SLE是一种常见的、累及全身的自身免疫性疾病,中华医学会风湿病学分会在SLE诊断及治疗指南[2]中指出,SLE的anti-dsDNA特异性为95%,敏感性为70%,但该诊疗指南并未对检测方法进行限定。正是由于不同的检测方法和不同的试剂会对结果产生不同影响,目前anti-dsDNA的检测没有一个规范的方法和流程,各种方法和试剂检测结果之间的差异悬殊,如何在现有条件下使用合适的检测方法,最终为临床诊断提供更有价值的实验室诊断结果是亟需解决的问题。目前检测anti-dsDNA的方法主要有绿蝇短膜虫间接免疫荧光实验(CLIFT)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、线性免疫印迹法(LIA)等。本研究旨在通过对常用实验方法进行对比,评价出能更好检测血清中anti-dsDNA的方法,以期找到一种在临床上检测anti-dsDNA的最佳方案。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年6～12月就诊于四川省人民医院申请抗核抗体谱检测的临床住院患者标本90例,其中男15例,年龄19～47岁；女75例,年龄14～82岁。确诊SLE患者60例,其他疾病组(ODC)患者30例(包括干燥综合征4例,混合性结缔组织病5例,类风湿性关节炎5例,感染性疾病10例,心血管疾病6例),自身免疫性疾病(AID)患者的诊断均符合国际相关学会的诊疗指南。健康对照组(NC)30例(均无肝、肾病史及结缔组织病史),其中男10例,女20例,年龄19～41岁。送检样本均为待测患者清晨空腹静脉血,离心10 min(3 000 r/min)后分离血清在24 h内使用LIA方法进行抗核抗体谱(包括anti-dsDNA)检测,留取血清样本保存于-80 ℃,统一采用CLIFT和ELISA方法检测anti-dsDNA。

1.2 研究方法

1.2.1 LIA检测anti-dsDNA 采用德国欧蒙公司提供的抗核抗体谱(IgG)免疫印迹法检测,该试剂盒是将经亲和层析提纯的双链DNA(dsDNA)等抗原线性包被于硝酸纤维素膜上并经封闭处理,与待检血清中的自身抗体反应后,加入酶标记的抗人IgG,再加入底物显色,阳性结果在相应的位置出现棕色条带。实验操作严格按照说明书进行。

1.2.2 CLIFT检测anti-dsDNA 采用德国欧蒙公司提供的anti-dsDNAIgG检测试剂盒(间接免疫荧光法)检测。该试剂盒是将包被有绿蝇短膜虫的生物薄片和稀释的血清样本温育。如果样本是阳性,特异性IgG、IgA和IgM抗体与鞭毛虫抗原结合。在第2次温育时,荧光素标记的抗人IgG抗体与结合在生物基质上的抗体反应,形成荧光显微镜下所观察到的特异性荧光模式。实验操作严格按照说明书进行。

1.2.3 ELISA-Ⅰ 采用德国欧蒙公司提供的anti-dsDNAIgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)检测。该试剂盒中微孔里包被的是由鲑鱼精子中高度纯化的天然dsDNA和重组dsDNA。第1次温育时,稀释后的样本在微孔中反应,如果样本阳性,特异性IgG抗体(包括IgA和IgM)与抗原结合；然后加入酶标记的IgG(酶结合物)进行第2次温育；最后加入酶底物,发生颜色反应。实验操作严格按照说明书进行。

1.2.4 ELISA-II 采用苏州浩欧博生物医药有限公司(HOB)提供的anti-dsDNA高亲和力抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)检测。该试剂盒是通过将稀释后的血清样本加入包被有从胎牛胸腺中纯化的天然dsDNA的微孔板中进行温育。洗去未结合的血清成分后,在反应孔中加入辣根过氧化物酶标记兔抗人抗体(IgG),与表面结合的抗体进行第2次温育,洗去未结合的组分,加入TMB底物,底物在酶的催化下产生颜色反应。加入终止液终止反应,在450/630 nm 波长下用酶标仪测定吸光度。吸光度与样品anti-dsDNA高亲和力抗体的浓度成比例关系。实验操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。率的比较采用χ2检验,方法一致性比较采用Kappa检验, MedCalc 11.4.2.0用于ROC曲线分析,P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 性能指标

4种方法检测anti-dsDNA抗体的检测特性(来源于试剂盒说明书)(见表1)。

表1 4种检测方法的主要性能指标

2 结果

2.1 根据制造商建议临界值(cut-off)对4种方法检测不同组别血清anti-dsDNA的灵敏度和特异性分析

根据制造商建议的临界值(cut-off),对4种方法检测不同组别血清anti-dsDNA的结果进行分析处理并计算灵敏度和特异性。结果显示,4种方法检测anti-dsDNA,除CLIFT的特异性外,其余与生产厂商说明的灵敏度和特异性都有较大的差别(见表1)。ELISA-Ⅰ和ELISA-II结果按照制造商说明以定性结果与其他方法比较。ELISA-Ⅰ和LIA、CLIFT之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)；ELISA-II与LIA、CLIFT、 ELISA-I之间比较,差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 根据厂家建议cut-off值4种方法检测anti-dsDNA的灵敏度及特异性

与LIA,CLIFT, ELISA-I之间比较,*P<0.01

2.2 方法间的一致性比较分析

应用Kappa检验来分析方法间检测结果的一致性,一般认为,Kappa值在0.410～0.600之间表示中等程度相关,0.610～0.800表示较高程度相关,0.810～1.000表示高度相关,4种方法间的一致性比较结果(见表3)。

表3 方法间的一致性比较结果

2.3 两种ELISA方法检测结果分布图

两种ELISA方法检测anti-dsDNA结果分布图(见图1、图2)。

图1 ELISA-Ⅰ检测结果分布图

2.4 两种ELISA方法检测anti-dsDNA的ROC曲线分析

ROC曲线是一种全面、准确评价诊断试验的工具,ROC曲线下面积(area under the ROC curve, AUC)是反映诊断试验准确性的关键指标,通常认为其取值在0.70～0.90时具有中等的诊断准确性,两种ELISA检测anti-dsDNA的ROC曲线分析可见,ELISA-Ⅰ的AUC为0.764,ELISA-II的AUC为0.882,ELISA-Ⅰ的最佳截断点(cut-off point)为79.361,ELISA-II的cut-off point为47.108(见图3)。

图2 EITSA-II检测结果分布图

图3 ELISA-Ⅰ和ELISA-II的ROC曲线

2.5 根据ROC曲线分析得出的cut-off point,ELISA-Ⅰ和ELISA-II检测anti-dsDNA灵敏度和特异性分析

根据ROC曲线分析得出的cut-off point,对两种ELISA方法检测不同组别血清anti-dsDNA的结果进行分析处理并计算灵敏度和特异性,可看出灵敏度有所提高,同时特异性有所降低(见表4)。

2.6 根据ROC曲线将特异性设为95%时ELISA-Ⅰ和ELISA-II检测anti-dsDNA灵敏度分析

根据ROC曲线将分析特异性设为95%时,对两种ELISA方法检测不同组别血清anti-dsDNA的结果进行分析处理并计算灵敏度,可看出随着特异性提高,两种ELISA方法检测anti-dsDNA的灵敏度都有很大程度下降(见表5)。

表4 根据ROC曲线分析得出的cut-off point,ELISA-Ⅰ和ELISA-II检测anti-dsDNA的灵敏度及特异性

表5 根据ROC曲线将特异性设置为95.00%时ELISA-Ⅰ和ELISA-II检测anti-dsDNA的灵敏度及特异性

3 讨论

SLE是一种系统性自身免疫性疾病,患者血清中含有多种自身抗体[3]。SLE患者血清中存在一种能与天然脱氧核糖核酸(DNA)结合的成分,称之为anti-dsDNA。anti-dsDNA与SLE高度相关,是SLE的特异性抗体之一,也是SLE的重要诊断依据之一[4,5]。目前临床应用于检测anti-dsDNA的方法各有利弊。放射免疫(Farr)检测anti-dsDNA出现最早,具有只结合高亲和力抗体的独特优势,特异性好,曾被列为检测anti-dsDNA的金标准。但其缺点是有放射性、检测周期长、易受到血清中高亲和力IgM的干扰、且不能自动化,现在临床实验室中已经很少采用[6,7]。故本研究未选择该方法。

本研究采用的LIA检测anti-dsDNA,该实验在SLE患者中阳性率为58.33%,在ODC组中阳性率为50.00%,NC组中阳性率为6.67%,对SLE的诊断特异性为71.67%,为4种方法中最低。由于其抗原是包被在膜条上面,温度、湿度等因素均可影响检测结果,故敏感性较低,特异性也不够。CLIFT使用的是绿蝇短膜虫天然DNA(dsDNA,nDNA)来检测anti-dsDNA。绿蝇短膜虫动基体内只含有ds DNA,而不含有其它人细胞核成分抗原,因此和动基体反应的抗核抗体必然是anti-dsDNA,其具有高度特异性。本研究中该实验在SLE患者中的检测灵敏度为56.67%,但其特异性为100.00%,可见CLIFT是对SLE高度特异的诊断实验。ELISA-I使用的是欧蒙公司提供的酶联免疫吸附试剂盒,本研究中该实验在SLE患者中的灵敏度为51.67%,在ODC组中的阳性率为10.00%,在NC组的阳性率为3.33%,特异性为93.33%。 ELISA-II是使用的苏州 HOB公司提供的酶联免疫吸附试剂盒,本研究中该实验在SLE患者中的灵敏度为73.33%,在ODC组中的阳性率为23.33%,在NC组中阳性率为3.33%,特异性为86.67%。可以观察到：4种方法检测anti-dsDNA的灵敏度和特异性与制造商的说明都有较大差别。

从表3可以看出,4种检测anti-dsDNA的方法间都具有中等程度以上的一致性(Kappa：0.545～0.677),相关性最低的是ELISA-I和ELISA-II之间,Kappa为0.545。本研究中,ELISA-Ⅰ与LIA、CLIFT之间比较检测结果,差异无统计学意义(P>0.05);但ELISA-Ⅱ与LIA、CLIFT、ELISA-Ⅰ之间比较检测结果,差异均具有统计学意义(P<0.01)。Pisetsky[1]在其综述中指出,DNA的构象、来源、碱基组成、大小、流动性以及固相和液相都会对anti-dsDNA的检测有很大影响。在一些有关方法学比较的文献[8,9]中可看出,anti-dsDNA的检测因为试剂盒中抗原的来源不同而引起灵敏度和特异性的差异,直接导致检测结果的一致性偏低。本研究中4种方法所用靶抗原来源均不相同,因此,实验所造成的差异大多来源于此。LIA是将抗原直接包被在膜条上的一种检测anti-dsDNA的实验,在本研究中其灵敏度与其它3种方法接近,但特异性不够,本研究中为71.67%,在其它疾病患者血清中亦可查见,这与Yang等[10]的研究结果一致。考虑到其特异性不够,故临床应用时只能作参考,尚不能满足临床诊断的需要。CLIFT以绿蝇短膜虫虫体为包被基质,其上只含有一个单纯的、完整的dsDNA分子,不含有任何其他物质,特异性好；由于只结合血清中的高亲和力抗体,故灵敏度有一定限制。本研究可观察到,在60例SLE血清中,ELISA-II检测为阳性的样本有16.67%用CLIFT检测为阴性,Antico等[6]在相关的研究中也证明了这一点。由于其高度的特异性,CLIFT方法可以用做anti-dsDNA检测的确证实验。ELISA-Ⅰ和ELISA-II的靶抗原分别为从鲑鱼精子、胎牛胸腺中提取的天然dsDNA,其缺点在于提取纯化过程中容易受到污染而影响特异性,但其成本低廉、操作简便,易于在实验室展开,本研究中可观察到两种ELISA方法都具有较高的灵敏度和特异性,可用做anti-dsDNA检测的筛查实验。

从ROC曲线分析可以看出,ELISA-I的AUC为0.764,ELISA-II的AUC为0.882,说明两种ELISA方法用于anti-dsDNA的检测都有一定准确性,但由于抗原来源不同,检测结果差异有统计学意义(P<0.01)。当采用ROC曲线给出的cut-off point时,ELISA-I的灵敏度提高到55.00%,但其特异性降低到91.67%；ELISA-II的灵敏度提高到81.67%,但其特异性降到83.33%。如果将两种方法的特异性都设置为95.00%,可以看到灵敏度分别降到48.33%和50.00%。所以,各个实验室应该根据实验的用途通过大样本的ROC曲线分析,使用合适的cut-off point值。

综上所述,4种anti-dsDNA的检测试剂由于靶抗原和检测方法的不同,因而检测结果也不尽相同。考虑到LIA较低的灵敏度和特异性,不推荐用于anti-dsDNA的检测。ELISA-Ⅰ和ELISA-II由于其简便的操作、较好的灵敏度和特异性,用做anti-dsDNA的筛查时可以任选1个或者同时选择两种不同抗原来源的ELISA方法来做筛查,以减少误差。CLIFT虽然灵敏度不如新一代ELISA,由于其检测结果对SLE的高度特异性,可以用做anti-dsDNA的确证实验。Antico 等[6]经过多中心的研究后提出,新一代酶免分析检测anti-dsDNA可以替代Farr和CLIFT方法,Haque[11]以及Andrejevic等[12]在研究中也指出,ELISA检测anti-dsDNA是敏感的诊断工具,但本研究观察到,在特异性上ELISA检测anti-dsDNA明显低于CLIFT。根据本研究结果建议,鉴于ELISA法操作简便、易于自动化、可定量、高通量,并具有良好的灵敏度,因此可作为anti-dsDNA的筛查实验,而CLIFT特异性最佳,可作为确证实验。无论临床实验室采取何种检测方法,针对anti-dsDNA的阳性检测结果,实验室工作人员应与临床医生始终保持足够的联系和沟通,并意识到临床实验室选择不同anti-dsDNA检测方法的灵敏度和特异性差异问题。

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Study on Anti-dsDNA Antibody Detection Strategies

TANTai-chang1,WANGTing2,ZHANGHang-feng1*,LONGWu-bin3

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China; 2.LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China; 3.DepartmentofRheumatologyandImmunology,SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To look for the optimum solution of anti-double-stranded-DNA (anti-dsDNA) antibodies detection. Methods To address the test feature of anti-dsDNA antibodies detection by different test methods, the performances of four immunoassays were compared. These included Line Immunoassay (LIA), crithidia Luciliae Immunofluorescence test (CLIFT) and two enzyme-linked immunoassays (ELISA). The sample set included 60 sera from systemic lupus erythematosus (SLE); 30 from other diseases (ODC) and 30 from the normal control group(NC). Results The sensitivity and specificity of these four assays were 58.33% and 71.67% (LIA),56.67% and 100.00% (CLIFT), 51.67% and 93.33% ( ELISA-Ⅰ), 73.33% and 86.67% ( ELISA-Ⅱ) respectively. There were no significant differences among LIA, CLIFT and ELISA-Ⅰ (P>0.05), but ELISA- Ⅱ showed the highest sensitivity (P<0.01). In ROC curve analysis, ELISA-Ⅰand ELISA- Ⅱshowed AUC values of 0.764 and 0.882. When calculated by using the cut-off point of ROC curve, the sensitivity and specificity of ELISA-Ⅰwere 55.00% and 91.67%; ELISA-Ⅱ were 81.67% and 83.33%. When evaluated by increasing the specificity values to 95.00%, the sensitivity of ELISA-Ⅰdecreased to 48.33%, ELISA- Ⅱ to 50.00%. Conclusion Four different assays showed various test features. Both CLIFT and ELISA are suitable for the routine test of anti-dsDNA antibodies in clinical laboratory. Due to the fact that ELISA showed the highest sensitivity, it can be used for screening purpose,CLIFT had the highest specificity, and can be used as a confirmation test. Regardless of the testing strategy among individual laboratories, clear communication with the clinical staff regarding the significance of a positive result is imperative. The laboratory and the clinician must both be aware of the sensitivity and specificity of each testing method used in the clinical laboratory.

Anti-Double-Stranded DNA Antibocly; Systemic Lupus Erythematosus; Indirect Immunofluorescence Assay; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; Immunoblotting Assay

中国高校医学期刊临床专项资金(NO:11321500)

张航烽,E-mail:sinotan@sina.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140415.1045.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.006

R446.6

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