镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性与其致病力相关分析

张潇丹, 廖静静, 邓维萍, 宋冬冬, 梅 琼, 朱书生, 杨 敏

(云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明 650201)

镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性与其致病力相关分析

张潇丹, 廖静静, 邓维萍, 宋冬冬, 梅 琼, 朱书生, 杨 敏*

(云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明 650201)

试验采用菌丝生长速率法测定了大蒜根系分泌物对3种供试植物病原镰刀菌的抑菌活性，并进一步分析了18株从腐烂蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌和12株从小麦赤霉病样分离的禾谷镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性及致病力之间的关系。研究结果表明，大蒜根系分泌物对供试镰刀菌均具有抑制活性，但从腐烂蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌对根系分泌物的敏感性低于其他菌株。致病力分析结果表明，供试的18株尖孢镰刀菌均能使蒜瓣发病，但致病力与其对根系分泌物的敏感性无明显相关性；供试的禾谷镰刀菌中对根系分泌物不敏感的4株菌株能侵染蒜瓣，但敏感性高的菌株不能侵染蒜瓣，且根系分泌物对禾谷镰刀菌的抑制率与禾谷镰刀菌致病力之间呈显著的负相关。这表明大蒜根系分泌抑菌物质是根系抵御镰刀菌侵染的重要机制，但一些菌株能对根系分泌物产生抗性，从而侵染大蒜。综上所述，大蒜根系分泌物对镰刀菌具有抑制活性，可以利用大蒜和其他作物间作或轮作控制镰刀菌枯萎病的发生和蔓延，但长期利用大蒜轮作或间作控制土传病害可能面临镰刀菌对大蒜根系分泌物产生抗性，导致防效降低的风险。

大蒜； 根系分泌物； 尖孢镰刀菌； 禾谷镰刀菌； 敏感性； 致病力

镰刀菌(Fusarium)寄主范围广，可引起植物根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，是生产上最难防治的病害之一[1]。目前用于防治镰刀菌引起的土传病害的方法主要有选育抗病品种[2-4]、化学防治[5-6]和生物防治[7]等，但对该病的防治效果均不理想。生产实践表明，轮作和间作是减轻土传病害的有效方法之一[8-9]。生产上尤其以葱属作物与其他作物间作或轮作对土传病害的防治效果好[10-13]。已有研究表明，一些植物释放的根系分泌物可以抑制病原菌的生长，减少土壤中土传病原菌的数量，增加土壤中有益微生物的活性，从而达到控制土传病害的效果[14-16]。大蒜具有广谱的抑菌活性[17]，生产上利用大蒜轮作或间作能有效降低多种镰刀菌引起的根腐病的危害，但生产中也发现大蒜轮作效果不稳定、且大蒜自身也能被病原菌侵染致病等现象，这可能与病原菌对大蒜根系分泌物的敏感性差异有关。本试验以大蒜和非大蒜上分离的镰刀菌为研究对象，分析镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性差异及其致病力之间的关系，以期为合理地利用大蒜间作和轮作控制土传病害的发生和蔓延提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试大蒜

白皮蒜(AlliumsativumLinn.)蒜瓣，市售。

1.1.2 供试病原菌

本试验供试镰刀菌分别为从黄瓜、小麦、水稻、甘蓝、大蒜上分离的镰刀菌(表 1)。

表1 供试镰刀菌Table 1 Fusarium isolates for testing

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜根系分泌物的收集

1.2.1.1根系分泌物自动连续收集

参照Tang的方法[18-19]，利用自制的根系分泌物连续收集装置收集大蒜根系分泌物。首先，将颗粒饱满，大小均一的新鲜蒜瓣置于4 ℃冰箱中低温催芽处理96 h；选择出芽长度一致的蒜瓣进行表面消毒后播入无底玻璃瓶中的石英砂内培养。玻璃瓶中的石英砂需要用2 mol/L的HCl浸泡24 h后用自来水冲洗后置于干热灭菌器中160 ℃灭菌4 h；玻璃瓶底部用玻璃棉隔离，避免石英砂随液体流出。玻璃棉需先在2 mol/L的HCl中浸泡24 h，用自来水冲洗干净。播种大蒜后将玻璃管的阀门关闭，用Hoagland营养液灌入无底玻璃瓶至石英砂饱和。从第2周开始每周浇1次1倍Hoagland营养液至石英砂饱和。培养20 d后，放出营养液残汁，先用去离子水冲洗4次，再用无菌水冲洗2次，然后组装根系分泌物收集装置，进行分泌物的连续收集。将XAD-4中性交换树脂(Sigma)经甲醇淋洗后用甲醇浸泡直至装柱。循环收集大蒜的根系分泌物3 d；取下树脂填充柱，以甲醇洗脱4次，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪进行减压蒸干，再加入5 mL CH2Cl2溶解，用0.45 μm的有机相滤膜过滤后，作为根系分泌物母液于4 ℃冰箱避光保存备用。

1.2.1.2砂培法收集

参照Shen的方法[20]，利用砂培法收集大蒜根系分泌物。首先，砂培大蒜，处理方法同上。待大蒜生长20 d后，将玻璃管的阀门打开，放出营养液残汁，同样先用去离子水冲洗4次，再用无菌水冲洗2次。在无底玻璃瓶中加入蒸馏水培养大蒜，保持水面与石英砂表面平齐，待大蒜生长3 d后，打开玻璃管阀门，收集培养液。用CH2Cl2萃取培养液，并在旋转蒸发仪上浓缩，方法同上。得到根系分泌物母液，于4 ℃冰箱避光保存备用。

1.2.1.3有机溶剂蘸根法收集

参照贾黎明等的方法[21]，利用有机溶剂蘸根法收集大蒜根系分泌物。首先，砂培大蒜，处理方法同上。待大蒜生长20 d后，取出大蒜，清除大蒜根部的石英砂，尽量不伤及根部，把根部放入含有0.5%乙酸的CH2Cl2提取液中浸泡3 s。然后过滤提取液，在旋转蒸发仪上浓缩，处理方法同上。得到根系分泌物母液，于4 ℃冰箱避光保存备用。

1.2.2 不同方法收集的大蒜根系分泌物对供试镰刀菌的抑菌活性测定

采用菌落直径法测定大蒜根系分泌物对供试镰刀菌的抑菌活性。将不同方法收集的大蒜根系分泌物按照0.01 mL/mL的比例混入PDA培养基中，制成含有大蒜根系分泌物的PDA平板。然后，沿生长4 d的菌落边缘打取直径为0.5 cm的菌饼，将菌饼接种于培养基中央，以加同样比例CH2Cl2的PDA平板作为对照，每一浓度设置3次重复。置于25 ℃恒温培养箱内黑暗培养，培养3～5 d后，待空白对照菌落长至培养皿的2/3左右，采用“十字交叉法”测量菌落直径。

1.2.3 大蒜根系分泌物对禾谷镰刀菌及尖孢镰刀菌的抑制活性测定

根系分泌物连续收集法收集的母液分别以0.002、0.01、0.05 mL/mL的比例加入40 ℃的PDA培养基中摇匀制成平板。然后，沿生长4 d的镰刀菌菌落边缘打取直径为0.5 cm的菌饼，将菌饼接种于培养基中央，以加同样比例CH2Cl2的PDA平板作为对照，每一浓度设置3次重复。培养3～5 d后，待空白对照菌落长至培养皿的2/3左右，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 供试禾谷镰刀菌及尖孢镰刀菌对大蒜鳞茎的致病力测定

试验采用菌饼接种法，通过伤口和非伤口两种方式测定供试镰刀菌对大蒜鳞茎的致病力。首先选取健康大蒜鳞茎，在超净工作台中去皮，用3%次氯酸钠表面消毒，再用无菌水冲洗3次后置于灭菌的滤纸上。伤口接种方法为用灭菌的解剖刀在大蒜鳞茎基部斜面削一平面伤口，沿生长4 d的供试菌株菌落边缘打取直径为0.5 cm的菌饼，将菌饼接种于伤口位置。非伤口接种方法为将菌饼直接接种于健康大蒜鳞茎表面。接种后的大蒜鳞茎置于培养皿内用无菌水润湿的吸水纸上，于25 ℃恒温培养箱内黑暗培养，培养4 d后测量病斑面积。

1.2.5 数据分析

利用十字交叉法测量出菌株的菌落生长直径，求出各平均值带入公式计算。

抑制率(%)=

利用Excel 2003软件分析供试菌株对大蒜根系分泌物的敏感性及其对大蒜鳞茎的致病力之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 不同方法收集的根系分泌物的抑菌活性差异

试验利用根系分泌物自动连续收集装置、砂培法和有机溶剂蘸根法3种方法收集了大蒜根系分泌物，并比较了其抑菌活性。结果表明(表2)，在1%根系分泌物浓度条件下，3种方法收集到的大蒜根系分泌物对镰刀菌菌株生长的抑制率差异极显著(P<0.01)，利用自动连续收集装置收集获得的根系分泌物抑菌活性最高，砂培法次之，有机溶剂蘸根法获得的根系分泌物抑菌活性最低，甚至会促进镰刀菌的生长。镰刀菌不同菌株间对根系分泌物的敏感性存在差异，供试菌株Fg409、FoB和FoC对根系分泌物的敏感性高于菌株FoG和Fm。

2.2 供试禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性及其致病力测定

试验进一步分析了从小麦赤霉病样上分离的12株禾谷镰刀菌和从腐烂蒜瓣上分离的18株尖孢镰刀菌对采用自动连续收集装置收集的大蒜根系分泌物的敏感性差异。结果表明(表3)，不同禾谷镰刀菌对根系分泌物的敏感性差异较大。当根系分泌物浓度为0.002 mL/mL时抑制率为2.2%～49.1%，平均抑制率为26.62%；浓度为0.01 mL/mL时抑制率为3.9%～54.3%，平均抑制率为31.71%；浓度为0.05 mL/mL时抑制率为5.2%～57.8%，平均抑制率为39.58%。供试尖孢镰刀菌对根系分泌物的敏感性低于禾谷镰刀菌，且对根系分泌物的敏感性分布较为集中(表3)。当根系分泌物浓度为0.002 mL/mL时抑制率为4.1%～19.2%，平均抑制率为9.8%；浓度为0.01 mL/mL时抑制率为18.4%～29.2%，平均抑制率为24.5%；当浓度为0.05 mL/mL时抑制率为20.5%～29.2%，平均抑制率为26.1%。

表2 三种方法收集到的大蒜根系分泌物对镰刀菌的抑制活性1)Table 2 The inhibition activity of garlic root exudates collected with three methods to Fusarium isolates

1) 平均值±标准误后不同字母表示具有极显著差异(P<0.01)。该抑制率是在根系分泌物浓度为1%的条件下测定获得。
Data are mean ± SE.Different letters in the same column indicate significant difference by Duncan’s test(P<0.01). The strain growth inhibition of garlic root exudates was tested at the concentration of 1%.

尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌对大蒜鳞茎的致病力测定结果表明(表3)，两种镰刀菌只能通过伤口侵染。从腐烂蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌均能致病，但致病力存在差异。供试的禾谷镰刀菌除Fg204、Fg471、Fg379和Fg353不能致病外，其他禾谷镰刀菌也能侵染大蒜鳞茎。

表3 大蒜根系分泌物对供试镰刀菌的抑制活性及镰刀菌对大蒜鳞茎的致病力Table 3 The inhibition activity of garlic root exudates to Fusarium isolates and the pathogenicity of Fusarium to garlic bulb

2.3 禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性与其致病力相关性分析

供试禾谷镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性与其致病力相关性分析结果表明(图1)，根系分泌物浓度为0.002、0.01、0.05 mL/mL时，大蒜根系分泌物对禾谷镰刀菌的抑制率与禾谷镰刀菌侵染大蒜的病斑面积之间的相关系数分别为-0.700 4、-0.657 6、-0.684 3，表现显著负相关(P≤0.05)。因此，不同浓度的根系分泌物对禾谷镰刀菌的抑制率与禾谷镰刀菌的致病力之间均呈负相关，即随着根系分泌物对禾谷镰刀菌抑制活性增加，菌株对大蒜鳞茎的致病力降低。

图1 大蒜根系分泌物对禾谷镰刀菌的抑制率与禾谷镰刀菌对大蒜致病力相关分析Fig.1 The correlation analysis between the inhibition rate of F. graminearum to garlic root exudates and the virulence of F. graminearum to garlic bulb

供试尖孢镰刀菌对大蒜根系分泌物的敏感性与其致病力相关性分析结果表明(图2)，供试尖孢镰刀菌对大蒜鳞茎均能致病，但其对根系分泌物的敏感性与其对大蒜鳞茎的致病力间无明显相关性。

图2 大蒜根系分泌物对尖孢镰刀菌的抑制率与尖孢镰刀菌对大蒜致病力相关分析Fig.2 The correlation analysis between the inhibition rate of F. oxysporum to garlic root exudates and the virulence of F. oxysporum to garlic bulb

3 结论与讨论

本研究结果表明，大蒜根系分泌物对引起作物病害的尖孢镰刀菌及禾谷镰刀菌等均具有抑制活性。试验比较了利用根系分泌物自动连续收集装置、砂培法和有机溶剂蘸根法收集的大蒜根系分泌物的抑菌活性，自动连续装置收集的根系分泌物抑菌活性最高，砂培法次之，有机溶剂蘸根法最低。这与不同的收集方法对根系分泌物的富集程度有关，自动连续收集装置采用的XAD-4树脂对根系分泌物中的疏水化合物具有吸附效应。众多的研究表明，植物根系能分泌抑菌物质抵御病原菌的侵染[15-16,22]。Bais等将拟南芥根系分泌的抑菌物质用活性炭吸附后，对根系分泌抑菌物质非常敏感的非寄主病原菌(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola)也能使拟南芥致病[23]。大蒜根系分泌物具有抑菌活性可能与其含有大蒜素类物质有关。大蒜中含有的主要抑菌活性物质是大蒜素及其降解产物，这些化合物具有广谱的抑菌活性[24-26]。大蒜素也能通过根系分泌物释放到根际环境中[27]，本研究收集的根系分泌物具有抑菌活性可能也与这些化合物有关。因此，生产上利用大蒜间作或轮作能控制镰刀菌引起的根腐病与根系分泌抑菌物质有关。

本试验从腐烂蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌对根系分泌物的敏感性明显低于从小麦上分离的禾谷镰刀菌，这表明镰刀菌对大蒜根系分泌物也能产生抗性。因此，在利用大蒜与其他作物间作或轮作控制镰刀菌引起的病害的过程中也面临镰刀菌对根系分泌物产生抗性，从而防效降低的风险。进一步分析表明，从小麦上分离的禾谷镰刀菌多数菌株对大蒜根系分泌物敏感且对大蒜鳞茎不致病，但一些敏感性低的菌株也能侵染蒜瓣。这表明禾谷镰刀菌对根系分泌物产生抗性后也具有致病能力。前人的研究也表明，病原菌对寄主抗菌物质的抗性与致病力有关，病原菌可以通过代谢解毒、有毒物质外排等机制降低植物分泌的抗菌物质对其产生的危害，从而增强病原菌侵染植物的能力[28]。该结果表明，镰刀菌对大蒜根系分泌物的抗性是其具有致病能力的重要因素之一。

综上所述，大蒜根系分泌物对引起大蒜腐烂的尖孢镰刀菌和引起小麦赤霉病的禾谷镰刀菌均具有抑菌活性，但对引起蒜瓣腐烂的尖孢镰刀菌的抑菌能力显著低于引起小麦赤霉病的禾谷镰刀菌，且禾谷镰刀菌中对大蒜根系分泌物敏感性低的菌株对蒜瓣也具有致病能力。这表明利用大蒜根系分泌抗菌物质的特性进行间作或轮作可以防治由镰刀菌引起的土传病害，但长期种植也可能面临镰刀菌对大蒜根系分泌物产生抗性，从而防效降低的风险。

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CorrelationanalysisofthesensitivityofFusariumspp.togarlicrootexudatesandtheirpathogenicitytogarlicbulb

Zhang Xiaodan, Liao Jingjing, Deng Weiping, Song Dongdong, Mei Qiong, Zhu Shusheng, Yang Min

(KeyLaboratoryofAgriculturalBiodiversityforPlantDiseaseManagement,MinistryofEducation,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

The method of mycelia growth rate was used to determine the antifungal activity of garlic root exudates to theFusariumisolates, and the relationships between the pathogenicity of 18F.oxysporumisolates from rotten garlic and 12F.graminearumisolates from wheat scab samples and their sensitivity to garlic root exudates were analyzed. The results indicated that the root exudates of garlic showed antifungal activity to allFusariumisolates. However, the isolates ofF.oxysporumfrom rotten garlic showed lower sensitivity to the root exudates. Pathogenicity tests showed that the 18 isolates ofF.oxysporumfrom rotten garlic could infect garlic, but there was no correlation between the sensitivity ofF.oxysporumisolates and their pathogenicity to garlic. Only four isolates ofF.graminearumwith low sensitivity exhibited pathogenicity to garlic, but the isolates ofF.graminearumwith high sensitivity could not infect garlic. In addition, there was an apparent negative correlation between antifungal activity of garlic root exudates and pathogenicity ofF.graminearumto the garlic. These results indicated that the exudation of inhibitive ingredients in garlic roots was the important defence mechanism of garlic roots againstFusariuminfection, but some strains could generate resistance to the garlic root exudates. Based on this study, it is known that the root exudates of garlic showed antifungal activity toF.oxysporumandF.graminearum, so garlic may be used for control of root disease by intercropping and rotation with other crops. But after long-term intercropping or rotation with other crops, there might be a risk thatFusariumcould generate resistance to the garlic root exudates, causing lower control effect.

garlic; root exudate;Fusariumoxysporum;Fusariumgraminearum; sensitivity; pathogenicity

2013-12-09

：2014-05-30

国家重点基础研究发展计划项目(2011CB100400)；国家自然科学基金(31260447)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.010

* 通信作者 Tel:0871-65220591，E-mail：yangminscnc@126.com